白云，孫強(qiáng)，包順茹，章艷

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

缺血性腦血管疾病又稱腦缺血，是一種嚴(yán)重危害老年人健康和生存質(zhì)量的常見病，具有發(fā)病率高、致殘率高、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，居腦血管病死亡原因之首，因而對(duì)缺血性腦血管疾病的研究就顯得十分迫切［1］。腦缺血在中醫(yī)學(xué)中屬“中風(fēng)”范疇。中風(fēng)的中醫(yī)藥治療歷史悠久，中藥由于多成分、多層次和毒副作用小、協(xié)同作用強(qiáng)的特點(diǎn)，在腦缺血的預(yù)防、治療與康復(fù)方面呈現(xiàn)顯著優(yōu)勢(shì)［2－3］。本課題組以“瘀血生風(fēng)”假說為基礎(chǔ)，提出活血熄風(fēng)方。此方經(jīng)臨床實(shí)踐驗(yàn)證，對(duì)中風(fēng)患者具有確切療效。本課題組在前期已經(jīng)證實(shí)活血熄風(fēng)方對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用的基礎(chǔ)上［4－5］，通過檢測(cè)對(duì)模型大鼠腦組織 NF － κBp65蛋白的表達(dá)情況，以期進(jìn)一步明確活血熄風(fēng)方抗腦缺血的作用機(jī)制，為研發(fā)出作用機(jī)制明確而安全有效的抗腦缺血中藥新藥奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，體質(zhì)量為270～350g，雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在室溫18℃ ～25℃、相對(duì)濕度40%～60%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠手術(shù)前12h開始禁食，自由飲水。

1.2 藥品、試劑

活血熄風(fēng)方(由當(dāng)歸、紅花、川芎等組成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室制備);銀杏葉片(批號(hào)101108，唐山榮大藥業(yè)有限公司);尼莫地平片(批號(hào)101201，西安博愛制藥有限公司);PV6001二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司);NF－κBp65抗體(美國(guó)SANTA Cruz公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Q500IW圖像分析儀(德國(guó)Leica);生物組織包埋機(jī)(湖北孝感)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

將Wistar大鼠隨機(jī)分成活血熄風(fēng)方高劑量組、中劑量組、低劑量組，銀杏葉片組，尼莫地平組，模型對(duì)照組和假手術(shù)組。除假手術(shù)組10只外，其余每組16只。

2.2 給藥方法

活血熄風(fēng)方高、中、低劑量組分別灌胃給予活血熄風(fēng)方10g/kg、5g/kg、2.5mg/kg;銀杏葉片組灌胃給予銀杏葉片135mg/kg;尼莫地平組灌胃給予尼莫地平片21.6mg/kg;模型對(duì)照組及假手術(shù)組灌胃給予等量生理鹽水。各組大鼠均連續(xù)灌胃給藥7天。

2.3 右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型制作

于末次給藥30min后，進(jìn)行右側(cè)MCAO阻塞模型手術(shù)。參照Longa［6］方法，并稍加改良，10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠仰臥位固定后，行頸正中線切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和近心端及頸外動(dòng)脈處分別掛線備用。用蛙心夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，距頸總動(dòng)脈分叉部4～5mm處剪一小口，隨后打開蛙心夾，用眼科鑷子輕推拴線(直徑0.23～0.25mm、長(zhǎng)3cm的魚線)，直至插入到頸內(nèi)動(dòng)脈中大約18mm左右，稍微感到阻力后停止進(jìn)線，系牢頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的細(xì)線，將傷口縫合，單籠飼養(yǎng)。

2.4 神經(jīng)功能評(píng)分

MCAO手術(shù)后，于大鼠意識(shí)恢復(fù)30min時(shí)，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。計(jì)分在1～3分者納入研究，每組選擇8只進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.5 大鼠腦組織NF－κBp65蛋白含量測(cè)定

上述評(píng)分合格大鼠，以10%水合氯醛(劑量為350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，立即開胸暴露心臟，將右心耳剪掉，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，將大約150ml肝素化生理鹽水于5min內(nèi)全部灌注于左心室中。隨后灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖溶液200ml。灌注完畢后，從大鼠枕骨大孔剪開，完整取出大鼠腦組織，于4℃相同固定液中固定，制作病理組織切片。隨后參照試劑盒說明書，以PV－6001二步法進(jìn)行操作。

2.6 結(jié)果判定

采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)，以細(xì)胞核出現(xiàn)鮮艷的棕黃色染色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，每張切片高倍鏡下隨機(jī)選擇不重合的5個(gè)視野，采用圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)拍照并計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS11.5 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用方差分析，所得數(shù)據(jù)用(±s)表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與假手術(shù)組相比，模型大鼠腦皮質(zhì)NF－κBp65蛋白表達(dá)有明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)活血熄風(fēng)方高劑量組、中劑量組、低劑量組及尼莫地平組、銀杏葉片組分別與模型對(duì)照組相比，模型大鼠腦皮質(zhì)NF－κBp65蛋白表達(dá)亦有增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(結(jié)果見表1、圖1)。

圖1 活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)

表1 活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)NF－κBp65蛋白表達(dá)的影響(±s)

表1 活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)NF－κBp65蛋白表達(dá)的影響(±s)

注:與模型對(duì)照組相比，*P＜0.05;模型對(duì)照組與假手術(shù)組相比，▲P ＜0.05。

組別 n 劑量(mg/kg)陽性細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組 8 等體積28.49 ±12.81模型對(duì)照組 8 等體積 42.08±6.56▲活血熄風(fēng)方高劑量組 8 10 35.18 ±4.70*活血熄風(fēng)方中劑量組 8 5 33.11 ±6.22*活血熄風(fēng)方低劑量組 8 2.5 34.70 ±7.46*銀杏葉片組 8 135 34.37 ±7.12*尼莫地平組 8 21.6 35.04 ±3.72*

4 討論

腦缺血是多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，因此從中藥中尋找多靶點(diǎn)、多途徑、多效應(yīng)的腦缺血治療藥物是一條有效途徑。本研究以“瘀血生風(fēng)”假說為理論基礎(chǔ)，提出活血熄風(fēng)方。此方由當(dāng)歸、紅花、川芎等多味中藥組成，具有活血化瘀、熄風(fēng)止痙之功效。經(jīng)多年臨床實(shí)踐證實(shí)，對(duì)腦缺血患者具有較好療效。為進(jìn)一步探討活血熄風(fēng)方抗腦缺血的作用機(jī)制，本研究通過觀察活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)NF－κBp65蛋白表達(dá)的變化，旨在為研發(fā)出作用機(jī)制明確、安全有效的防治腦缺血的中藥新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

NF－κB存在于神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中，是一種氧化應(yīng)激反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺血性腦損傷時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生將一系列內(nèi)源性因子參與到活化NF－κB的過程中。活化后的NF－κB可以促使即早基因、粘附分子、細(xì)胞因子和細(xì)胞表面受體等的表達(dá)。當(dāng)發(fā)生急性腦缺血時(shí)，在粘附分子的介導(dǎo)下，白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞中滾動(dòng)、粘附并且外漏，從而引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［7－10］。因此，NF － κB 被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的始動(dòng)機(jī)制之一。本研究中通過觀察活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)NF－κBp65蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)活血熄風(fēng)方能抑制MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)NF－κBp65的表達(dá)。由此，我們推測(cè)活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO模型大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制可能與其抑制NF－κBp65蛋白的表達(dá)有關(guān)。然而NF－κBp65是否參與了活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，亦或只是其伴隨現(xiàn)象，尚需今后通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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