曹慧靈， 但 伶， 鄧必高

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶400010)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)系革蘭氏陰性菌細胞壁組成成分，目前已明確，LPS通過復雜的信號轉導機制引起一系列級聯(lián)反應，可導致細胞變性和死亡，表現(xiàn)為組織結構損害和器官功能衰退[1]。其中p38 MAPK信號通路在介導細胞對LPS的激活反應中發(fā)揮著重要作用[2]。p38 MAPK激活后可誘導誘導型一氧化氮合酶(inducible－nitric oxide synthase，iNOS)表達上調(diào)[3]。異丙酚是一種鎮(zhèn)靜催眠靜脈麻醉藥，大量研究證明異丙酚具有腦保護作用，異丙酚可以降低LPS誘發(fā)的促炎細胞因子表達[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可以通過抑制MAPK信號通路來發(fā)揮其抗炎作用[5]。但異丙酚對大鼠LPS性腦損傷時p38 MAPK通路的活化尚未見報道，本研究擬通過觀察異丙酚對大鼠LPS性腦損傷時p38 MAPK通路活化和iNOS表達的影響，探討其減輕LPS性腦損傷的機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康清潔級SD大鼠72只，6周齡，雌雄不限，體重200－250g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑 LPS(E.coli，055∶B5，Sigma)，異丙酚(批號為0912211 XLH，四川國瑞藥業(yè)有限責任公司)，兔抗大鼠磷酸化p38 MAPK(p－p38 MAPK)多克隆抗體和兔抗大鼠iNOS多克隆抗體均購自Bioworld，RIPA裂解液(強)(碧云天生物技術研究所)，辣根酶標記山羊抗兔IgG和ECL化學發(fā)光液均購自Pierce，SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司。

2 方法

2.1 大鼠LPS性腦損傷模型的制備和分組 動物被隨機分為3組:正常對照組(C組)、LPS組(LPS組)和LPS+異丙酚組(LPS+P組)，各組按觀察時點分為 6、24、48、72 h 4個亞組。參照文獻[6]的方法，仰臥位固定大鼠，頸正中切口，充分暴露并分離左頸總動脈、左頸外動脈和左頸內(nèi)動脈。將左頸外動脈結扎，然后用微動脈鉗夾閉左頸總動脈近心端，穿刺左頸總動脈遠心端，LPS組、LPS+P組經(jīng)由左頸內(nèi)動脈注射LPS 1 mg/kg，15 s內(nèi)注射完畢，LPS+P組注射LPS后立即腹腔注射異丙酚100 mg/kg，C組分別于左頸內(nèi)動脈和腹腔給予與LPS和異丙酚等容量的生理鹽水。

2.2 標本制備 各組動物觀察至相應時點經(jīng)麻醉后快速斷頭取腦，在冰盤上迅速分離大腦皮質(zhì)，－80℃低溫冰箱保存待測p－p38 MAPK。在鼠腦中后1/3處，經(jīng)冠狀面切取腦片厚約3 mm，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，用于iNOS表達的測定和光鏡觀察，其余腦組織用于測定腦含水量。

2.3 腦組織形態(tài)學觀察 取大腦皮質(zhì)石蠟包埋，切片，HE染色后，光鏡下觀察病理學結果。

2.4 腦組織含水量的測定 稱腦組織濕重后，將其放入80℃烘箱內(nèi)烘烤36 h，稱干重，計算腦組織含水量，腦組織含水量=[(濕重－干重)/濕重]×100%。

2.5 Western blotting法檢測腦皮質(zhì)p－p38 MAPK的表達取腦皮質(zhì)組織0.02 g勻漿，經(jīng)RIPA裂解液提取蛋白，再用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。測完蛋白含量后，計算含50 μg蛋白的溶液體積為上樣量上樣，經(jīng)10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分離后，用濕法將蛋白條帶電轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗大鼠p－p38 MAPK多克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜，辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶5 000)37℃孵育2 h，采用化學發(fā)光法顯色，暗室中曝光、顯影、定影?？故螃拢璦ctin作為內(nèi)參照校正加樣蛋白濃度。采用Quantity One 4.6.2軟件進行蛋白條帶灰度分析，以反映p－p38 MAPK表達水平。

2.6 腦組織iNOS表達的測定 采用免疫組織化學方法進行檢測，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，滴加iNOS多克隆抗體(1∶100)后，按SABC試劑盒說明常規(guī)進行免疫組化染色，用PBS代替iNOS多克隆抗體作為陰性對照。光鏡下胞漿中有棕黃色顆粒的細胞為iNOS表達陽性細胞。光鏡下觀察并拍照，每張切片任選6個高倍視野，采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，以表達陽性細胞的吸光度反映iNOS表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，腦含水量與p－p38 MAPK、iNOS作直線相關分析。

結 果

1 光鏡結果

C組各時點HE染色大腦皮層結構清晰，細胞形態(tài)未見異常;LPS組大腦皮層可見彌散性灶性水腫區(qū)，神經(jīng)細胞周圍空暈增寬及細胞核固縮;LPS+P組各相應時點上述損傷程度較LPS組減輕，見圖1。

Figure 1.Pathological changes of brain tissues at 6 h(HE staining，×200).A:control group;B:LPS group;C:LPS+P group.圖1 6 h光鏡下大腦皮質(zhì)組織的病理學結果

2 腦組織含水量的表達

與C組比較，LPS組各時點腦組織含水量升高(P＜0.05)，與LPS組相比，LPS+P組腦組織含水量表達水平降低(P ＜0.05)，見表1。

3 p－p38 MAPK和iNOS蛋白表達

與C組比較，LPS組腦組織p－p38 MAPK和iNOS表達水平均于6 h開始增加，24 h達高峰，48 h及72 h各指標仍高于C組(P＜0.05);與LPS組相比，LPS+P組各時點pp38 MAPK和 iNOS表達水平降低(P＜0.05)，見表2和圖 2、3。

4 相關性分析

腦組織含水量與p－p38 MAPK、iNOS蛋白表達水平呈正相關(r=0.692，r=0.769，P ＜0.05)。

討 論

本研究通過頸內(nèi)動脈注射LPS制備腦損傷模型，HE染色光鏡下見LPS組神經(jīng)細胞周圍空暈增寬及細胞核固縮，表明發(fā)生了腦損傷。腦組織含水量是反映腦損傷重要指標，本研究結果表明，與C組比較，LPS組各時點腦組織含水量升高，提示LPS性腦損傷模型制備成功。

表1 不同時點腦組織含水量的比較Table 1.Comparison of brain water content(BWC)at different time points(%.±s.n=6)

表1 不同時點腦組織含水量的比較Table 1.Comparison of brain water content(BWC)at different time points(%.±s.n=6)

*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs LPS group.

Group 6 h 24 h 48 h 72 h C 78.3 ±0.4 78.4 ±0.5 79.0 ±0.5 78.3 ±0.3 LPS 83.2 ±0.5* 81.9 ±0.9* 80.9 ±0.8* 79.4 ±0.5*LPS+P 80.8 ±0.7*# 80.6 ±0.4*# 79.9 ±1.0*# 78.8 ±0.6#

Figure 2.Western blotting photograph showed the expression of p－p38 MAPK in brain cortex.圖2 Western blotting檢測各組大鼠腦皮質(zhì)p－p38MAPK表達

表2 不同時點p－p38 MAPK和iNOS的表達水平Table 2.Expression of p－p38 MAPK and iNOS in brain tissues at different time points(±s.n=6)

*P ＜0.05 vs C group;#P ＜0.05 vs LPS group.

Index Group 6 h 24 h 48 h 72 h p － p38 MAPK C 5.4 ±0.4 5.3 ±0.4 5.5 ±0.5 5.3 ±0.3 LPS 13.0 ±0.7* 19.6 ±0.7* 14.7 ±0.8* 12.6 ±0.8*LPS+P 8.0 ±0.9*# 10.2 ±0.5*# 9.0 ±0.8*# 7.5 ±1.5*#iNOS C 0.008 ±0.003 0.008 ±0.003 0.011 ±0.003 0.009 ±0.003 LPS 0.070 ±0.008* 0.119 ±0.009* 0.084 ±0.007* 0.061 ±0.003*LPS+P 0.055 ±0.004*# 0.091 ±0.004*# 0.064 ±0.006*# 0.045 ±0.005*#

p38 MAPK是1993年在脂多糖刺激小鼠巨噬細胞中首次發(fā)現(xiàn)的一種新的磷酸化蛋白激酶，屬于MAPK的亞類之一，是信號由細胞表面轉導到細胞內(nèi)部的重要傳遞者，在調(diào)節(jié)炎癥反應中具有重要作用[2]。p38 MAPK受到不同的細胞外刺激，包括LPS、促炎癥因子、紫外線等作用下，三肽區(qū)的蘇氨酸、酪氨酸雙磷酸化而被最終激活，p38 MAPK被上游的分子磷酸化后，即移入細胞核內(nèi)，進一步磷酸化下游的蛋白激酶和轉錄因子，從而上調(diào)炎癥細胞因子TNF－α、IL－1β等基因表達[7]。有報道 p38 MAPK信號通路可導致iNOS激活[8]。正常腦組織中iNOS幾乎不表達，iNOS活化后可誘導產(chǎn)生大量NO，一方面NO作為炎癥介質(zhì)，經(jīng)彌散進入細胞后，通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸鳥苷水平升高而發(fā)揮舒血管作用，引起血管通透性增加，并導致間質(zhì)水腫;另一方面NO與O2－結合生成過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO－)，而ONOO－是一種較強的氧自由基，可誘導細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，引起細胞膜完整性受損，抑制線粒體呼吸，導致細胞水腫、破裂、線粒體腫脹和溶酶體破裂[9]。本研究結果表明LPS組各時點腦組織p－p38 MAPK和iNOS表達高于C組，p－p38 MAPK蛋白水平在LPS組6 h開始升高，24 h達高峰，72 h仍有較高表達，且p－p38 MAPK、iNOS與腦含水量表達水平呈正相關，即p－p38 MAPK的時相變化水平與腦損傷病變過程基本一致，提示p38 MAPK通路參與LPS致大鼠腦損傷的發(fā)生和發(fā)展過程，其作用機制可能與p38 MAPK促進iNOS激活從而導致組織損傷有關。

異丙酚的腦保護作用機制包括抑制炎癥細胞因子的表達、抗氧化特性、調(diào)節(jié) γ－氨基丁酸受體等。最新研究表明在LPS刺激的RAW264.7細胞中異丙酚可抑制iNOS表達和NO生物合成[10]，異丙酚也可以通過抑制p38 MAPK激活，減輕細胞水腫[11]。本研究結果表明，與LPS組比較，LPS+P組腦損傷程度減輕，p－p38 MAPK與iNOS表達下調(diào)，提示異丙酚可能通過抑制p38 MAPK活化和iNOS表達，從而減輕LPS性腦損傷。

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