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        蜂膠抑制白血病K562細(xì)胞增殖機(jī)制的初步研究*

        2011-09-14 06:21:14戚之琳畢富勇
        中國病理生理雜志 2011年8期
        關(guān)鍵詞:蜂膠抑制率白血病

        汪 茗, 章 堯, 戚之琳, 畢富勇

        (皖南醫(yī)學(xué)院生化教研室,安徽蕪湖241002)

        蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物幼芽及樹木枝條上采集樹脂類物質(zhì),與其唾液混合加工而成的一種芳香性膠狀固體物,含有黃酮、萜烯、肉桂酸衍生物等300多種成分。蜂膠作為民間藥物,對于炎癥、腫瘤[1]、心臟病[2,3]等均具有治療或預(yù)防作用。核孔復(fù)合物貫穿于核膜,是胞核與胞質(zhì)物質(zhì)交換的唯一通道,在細(xì)胞正常生長、分化過程中發(fā)揮著重要作用。其中核孔蛋白98(nucleoporin 98,Nup98)是與白血病發(fā)病關(guān)系最密切的核孔蛋白。本研究通過觀察蜂膠對K562細(xì)胞Nup98表達(dá)的影響來探討蜂膠抗白血病作用的分子機(jī)制。

        材料和方法

        1 材料

        1.1 細(xì)胞株 人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。

        1.2 試劑 蜂膠標(biāo)準(zhǔn)品購自Anksteh,用組織培養(yǎng)級的DMSO配成1×105mg/L的貯存液,用時(shí)稀釋,使DMSO終濃度≤0.1%。PCR引物由上海生工合成。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物。鼠抗人Nup98單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz。

        2 方法

        2.1 分組 分對照組和蜂膠0.2、2、20、200 mg/L組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次,取均值。

        2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。將不同濃度的蜂膠摻入細(xì)胞,孵育一定時(shí)間后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.3 MTT檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞,調(diào)整濃度為1×108/L,接種于96孔板。蜂膠作用24、48、72 h后取出培養(yǎng)板,每孔加入MTT(5 g/L)20 μL,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,離心棄上清,加DMSO 150 μL,振蕩后酶標(biāo)儀570 nm下測定各孔的吸光度(absorbance,A)值,按下式計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(A對照-A實(shí)驗(yàn))/A對照×100%。

        2.4 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測 蜂膠作用24 h后收集細(xì)胞,Annexin V/PI雙染,按說明書處理,1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

        2.5 RT-PCR檢測 蜂膠作用24 h后,Trizol提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測RNA純度(A260/A280>1.8)。兩步法按試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增。Nup98上游引物 5'-CTAGCAAC AATACTGGAGGC -3',下游引物 5'- CCTGAATTAGTGGTGGAGGA -3',產(chǎn)物612 bp。β-actin 為內(nèi)參照,上游引物 5'-TGAGACCTTCAACACCCCAG- 3',下游引物 5'- GCCATCTCTTGCTCGAAGTC -3',產(chǎn)物 312 bp[4]。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 3 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min,4℃維持。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,EB染色,捷達(dá)801凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。ANup98/Aβ-actin表示Nup98 mRNA表達(dá)量的相對水平。

        2.6 Western blotting 檢測 收集總蛋白,按 100 μg/well上樣。10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至NC膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h,封Ⅰ抗 Nup98(1∶1 000)4℃過夜。第2 d TBST、TBS洗膜。封HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗(1∶5 000)45 min,同法洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光,將膜置于暗盒中,暗室內(nèi)膠片曝光,沖洗膠片。Gel-Pro Analyzer定量分析軟件分析結(jié)果。ANup98/AGAPDH表示Nup98蛋白表達(dá)量的相對水平。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié) 果

        1 蜂膠對K562細(xì)胞增殖的影響

        蜂膠作用 24、48、72 h 后,2 mg/L、20 mg/L 和 200 mg/L蜂膠組K562細(xì)胞的增殖抑制率均高于對照組(P<0.01),且具有時(shí)間和劑量依賴性。其中200 mg/L組72 h的增殖抑制率可達(dá)88.76% ±1.42%,見圖1。

        Figure 1.Effect of propolis on proliferation of K562 cells.±s.n=3.**P <0.01 vs A.圖1 蜂膠對K562細(xì)胞增殖的影響

        2 蜂膠對K562細(xì)胞凋亡的影響

        蜂膠作用24 h后,2 mg/L、20 mg/L和200 mg/L組誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡率明顯高于對照組(P<0.05),具有劑量依賴性,見圖2。圖中右上象限為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞,左下象限為陰性正常細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞,左上象限為機(jī)械性損傷細(xì)胞。早期凋亡百分?jǐn)?shù)與晚期凋亡百分?jǐn)?shù)總和為總凋亡率。200 mg/L組的細(xì)胞總凋亡率可達(dá)25.01% ±2.51%。

        Figure 2.Effect of propolis on apoptosis of K562 cells.±s.n=3.A:control;B:2 mg/L propolis;C:20 mg/L propolis;D:200 mg/L propolis.**P <0.01 vs A.圖2 蜂膠對K562細(xì)胞凋亡的影響

        3 RT-PCR檢測nup98mRNA表達(dá)

        由圖3可見,β-actin在各組中的表達(dá)水平相似。在612 bp處可見200 mg/L組nup98 mRNA水平明顯下調(diào)。200 mg/L組nup98 mRNA的相對表達(dá)量與對照組相比有顯著差異(P<0.01),見表1。

        4 Western blotting檢測Nup98蛋白表達(dá)

        由圖4可見,各組內(nèi)參照GAPDH的表達(dá)量未發(fā)生明顯變化,而Nup98蛋白表達(dá)量卻逐漸低于對照組,以200 mg/L組最為明顯。200 mg/L組Nup98蛋白的相對表達(dá)量與對照組相比有顯著差異(P<0.01),見表1。

        討 論

        Figure 3.Effect of propolis on the expression of nup98 mRNA in K562 cells.Lane 1:marker;Lane 2:control;Lane 3:2 mg/L propolis;Lane 4:20 mg/L propolis;Lane 5:200 mg/L propolis.圖3 蜂膠對K562細(xì)胞nup98 mRNA表達(dá)的影響

        表1 蜂膠對K562細(xì)胞Nup98 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

        表1 蜂膠對K562細(xì)胞Nup98 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

        *P <0.05,**P <0.01 vs control group.

        Group mRNA Protein Control 0.328 ±0.050 1.256 ±0.010 2 mg/L propolis 0.319 ±0.060 1.229 ±0.030 20 mg/L propolis 0.323 ±0.060 1.157 ±0.050*200 mg/L propolis 0.118 ±0.060** 0.895 ±0.040**

        Figure 4.Effect of propolis on the expression of Nup98 protein in K562 cells.Lane 1:control;Lane 2:2 mg/L propolis;Lane 3:20 mg/L propolis;Lane 4:200 mg/L propolis.圖4 蜂膠對K562細(xì)胞Nup98蛋白表達(dá)的影響

        已有研究表明,蜂膠可抑制大腸癌[5]、肺癌[6]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了在一定的范圍內(nèi),蜂膠也具有抑制白血病細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用,并呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系,這與之前的報(bào)道吻合。

        雖然蜂膠的抗腫瘤效應(yīng)已被證實(shí),但其作用機(jī)制卻未得到系統(tǒng)闡明。Ishihara等[5]的研究提示,蜂膠的咖啡酸苯乙酯通過降低cyclin D1和c-Myc的表達(dá),導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞G1期阻滯和凋亡。巴西蜂膠中的阿替比林C通過促進(jìn)p21CIP1mRNA表達(dá),阻滯細(xì)胞在 G0/G1期,抑制其增殖。Cogulu等[7]報(bào)道馬尼薩蜂膠可通過抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的活性抑制白血病細(xì)胞的增殖。也有研究表明蜂膠通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。

        Nup98基因位于11p15.5,編碼98 kD的核孔蛋白,位于細(xì)胞核的膜內(nèi)側(cè)及細(xì)胞核內(nèi)。主要參與調(diào)節(jié)核內(nèi)外蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。其N末端FG重復(fù)序列的異常與白血病發(fā)病關(guān)系密切,在許多急性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病急變期患者可檢測到與nup98有關(guān)的染色體易位、融合基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前認(rèn)為nup98-HOX融合基因的形成是白血病發(fā)病的重要原因。Kasper等[10]發(fā)現(xiàn) Nup98 N末端FG重復(fù)序列與CBP/P300結(jié)合起轉(zhuǎn)錄激活作用。也有人推測融合蛋白通過引起核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的缺陷而導(dǎo)致白血病的發(fā)生。還有研究提示Nup 98協(xié)同蛋白RAE-1(retinoic acid early inducible-1,視黃酸可誘導(dǎo)蛋白1)功能紊亂在白血病發(fā)生中可能發(fā)揮一定作用。

        為探討蜂膠抑制白血病增殖的作用機(jī)制,本研究檢測了不同濃度蜂膠作用K562細(xì)胞后Nup98表達(dá)的情況。結(jié)果提示,在抑制K562細(xì)胞增殖的過程中,Nup98的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均有下調(diào),提示Nup98表達(dá)下調(diào)參與了蜂膠抑制K562細(xì)胞增殖的過程。但Nup98下調(diào)后通過何種信號途徑引起增殖抑制,需要我們下一步進(jìn)行探索。

        [1]Mishima S,Narita Y,Chikamatsu S,et al.Effects of propolis on cell growth and gene expression in HL-60 cells[J].J Ethnopharmacol,2005,99(1):5 -11.

        [2]張?jiān)葡?,王家富,?偉,等.蜂膠水提液對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2008,24(1):60 -63.

        [3]張?jiān)葡?,陳文峰,王家富,?蜂膠水提物對血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(12):2311 -2315.

        [4]吳秋玲,陳 燕,陳衛(wèi)華,等.魚藤素對K562細(xì)胞nup98表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2007,15(1):25 -28.

        [5]Ishihara M,Naoi K,Hashita M,et al.Growth inhibitory activity of ethanol extracts of Chinese and Brazilian propolis in four human colon carcinoma cell lines[J].Oncol Rep,2009,22(2):349 -354.

        [6]Li F,Awale S,Tezuka Y,et al.Cytotoxicity of constituents from Mexican propolis against a panel of six different cell lines[J].Nat Prod Commun,2010,5(10):1601 -1606.

        [7]Cogulu O,Biray C,Gunduz C,et al.Effects of Manisa propolis on telomerase activity in leukemia cells obtained from the bone marrow of leukemia patients[J].Int J Food Sci Nutr,2009,60(7):601 -605.

        [8]Eom HS,Lee EJ,Yoon BS,et al.Propolis inhibits the proliferation of human leukaemia HL-60 cells by inducing apoptosis through the mitochondrial pathway[J].Nat Prod Res,2010,24(4):375 -386.

        [9]謝志堯,陳 竺.NUP98-HOXA9融合基因與白血病[J].國外醫(yī)學(xué):輸血及血液學(xué)分冊,2005,28(3):201 -203.

        [10]Kasper LH,Brindle PK,Schnabel CA,et al.CREB binding protein interacts with nucleoporin-specific FG repeats that activate transcription and mediate NUP98-HOXA9 oncogenicity[J].Mol Cell Biol,1999,19(1):764 -776.

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