汪 茗， 章 堯， 戚之琳， 畢富勇

(皖南醫(yī)學(xué)院生化教研室，安徽蕪湖241002)

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物幼芽及樹木枝條上采集樹脂類物質(zhì)，與其唾液混合加工而成的一種芳香性膠狀固體物，含有黃酮、萜烯、肉桂酸衍生物等300多種成分。蜂膠作為民間藥物，對于炎癥、腫瘤[1]、心臟病[2，3]等均具有治療或預(yù)防作用。核孔復(fù)合物貫穿于核膜，是胞核與胞質(zhì)物質(zhì)交換的唯一通道，在細(xì)胞正常生長、分化過程中發(fā)揮著重要作用。其中核孔蛋白98(nucleoporin 98，Nup98)是與白血病發(fā)病關(guān)系最密切的核孔蛋白。本研究通過觀察蜂膠對K562細(xì)胞Nup98表達(dá)的影響來探討蜂膠抗白血病作用的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2 試劑 蜂膠標(biāo)準(zhǔn)品購自Anksteh，用組織培養(yǎng)級的DMSO配成1×105mg/L的貯存液，用時(shí)稀釋，使DMSO終濃度≤0.1%。PCR引物由上海生工合成。Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物。鼠抗人Nup98單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 分組 分對照組和蜂膠0.2、2、20、200 mg/L組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取均值。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。將不同濃度的蜂膠摻入細(xì)胞，孵育一定時(shí)間后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×108/L，接種于96孔板。蜂膠作用24、48、72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，加DMSO 150 μL，振蕩后酶標(biāo)儀570 nm下測定各孔的吸光度(absorbance，A)值，按下式計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(A對照－A實(shí)驗(yàn))/A對照×100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測 蜂膠作用24 h后收集細(xì)胞，Annexin V/PI雙染，按說明書處理，1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

2.5 RT－PCR檢測 蜂膠作用24 h后，Trizol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測RNA純度(A260/A280＞1.8)。兩步法按試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增。Nup98上游引物 5＇－CTAGCAAC AATACTGGAGGC －3＇，下游引物 5＇－ CCTGAATTAGTGGTGGAGGA －3＇，產(chǎn)物612 bp。β－actin 為內(nèi)參照，上游引物 5＇－TGAGACCTTCAACACCCCAG－ 3＇，下游引物 5＇－ GCCATCTCTTGCTCGAAGTC －3＇，產(chǎn)物 312 bp[4]。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 3 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃維持。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，捷達(dá)801凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。ANup98/Aβ－actin表示Nup98 mRNA表達(dá)量的相對水平。

2.6 Western blotting 檢測 收集總蛋白，按 100 μg/well上樣。10%SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至NC膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，封Ⅰ抗 Nup98(1∶1 000)4℃過夜。第2 d TBST、TBS洗膜。封HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗(1∶5 000)45 min，同法洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光，將膜置于暗盒中，暗室內(nèi)膠片曝光，沖洗膠片。Gel－Pro Analyzer定量分析軟件分析結(jié)果。ANup98/AGAPDH表示Nup98蛋白表達(dá)量的相對水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 蜂膠對K562細(xì)胞增殖的影響

蜂膠作用 24、48、72 h 后，2 mg/L、20 mg/L 和 200 mg/L蜂膠組K562細(xì)胞的增殖抑制率均高于對照組(P＜0.01)，且具有時(shí)間和劑量依賴性。其中200 mg/L組72 h的增殖抑制率可達(dá)88.76% ±1.42%，見圖1。

Figure 1.Effect of propolis on proliferation of K562 cells.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs A.圖1 蜂膠對K562細(xì)胞增殖的影響

2 蜂膠對K562細(xì)胞凋亡的影響

蜂膠作用24 h后，2 mg/L、20 mg/L和200 mg/L組誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡率明顯高于對照組(P＜0.05)，具有劑量依賴性，見圖2。圖中右上象限為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，左下象限為陰性正常細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，左上象限為機(jī)械性損傷細(xì)胞。早期凋亡百分?jǐn)?shù)與晚期凋亡百分?jǐn)?shù)總和為總凋亡率。200 mg/L組的細(xì)胞總凋亡率可達(dá)25.01% ±2.51%。

Figure 2.Effect of propolis on apoptosis of K562 cells.±s.n=3.A:control;B:2 mg/L propolis;C:20 mg/L propolis;D:200 mg/L propolis.＊＊P ＜0.01 vs A.圖2 蜂膠對K562細(xì)胞凋亡的影響

3 RT－PCR檢測nup98mRNA表達(dá)

由圖3可見，β－actin在各組中的表達(dá)水平相似。在612 bp處可見200 mg/L組nup98 mRNA水平明顯下調(diào)。200 mg/L組nup98 mRNA的相對表達(dá)量與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，見表1。

4 Western blotting檢測Nup98蛋白表達(dá)

由圖4可見，各組內(nèi)參照GAPDH的表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，而Nup98蛋白表達(dá)量卻逐漸低于對照組，以200 mg/L組最為明顯。200 mg/L組Nup98蛋白的相對表達(dá)量與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，見表1。

討 論

Figure 3.Effect of propolis on the expression of nup98 mRNA in K562 cells.Lane 1:marker;Lane 2:control;Lane 3:2 mg/L propolis;Lane 4:20 mg/L propolis;Lane 5:200 mg/L propolis.圖3 蜂膠對K562細(xì)胞nup98 mRNA表達(dá)的影響

表1 蜂膠對K562細(xì)胞Nup98 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

表1 蜂膠對K562細(xì)胞Nup98 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group mRNA Protein Control 0.328 ±0.050 1.256 ±0.010 2 mg/L propolis 0.319 ±0.060 1.229 ±0.030 20 mg/L propolis 0.323 ±0.060 1.157 ±0.050*200 mg/L propolis 0.118 ±0.060＊＊ 0.895 ±0.040＊＊

Figure 4.Effect of propolis on the expression of Nup98 protein in K562 cells.Lane 1:control;Lane 2:2 mg/L propolis;Lane 3:20 mg/L propolis;Lane 4:200 mg/L propolis.圖4 蜂膠對K562細(xì)胞Nup98蛋白表達(dá)的影響

已有研究表明，蜂膠可抑制大腸癌[5]、肺癌[6]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了在一定的范圍內(nèi)，蜂膠也具有抑制白血病細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，并呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系，這與之前的報(bào)道吻合。

雖然蜂膠的抗腫瘤效應(yīng)已被證實(shí)，但其作用機(jī)制卻未得到系統(tǒng)闡明。Ishihara等[5]的研究提示，蜂膠的咖啡酸苯乙酯通過降低cyclin D1和c－Myc的表達(dá)，導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞G1期阻滯和凋亡。巴西蜂膠中的阿替比林C通過促進(jìn)p21CIP1mRNA表達(dá)，阻滯細(xì)胞在 G0/G1期，抑制其增殖。Cogulu等[7]報(bào)道馬尼薩蜂膠可通過抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的活性抑制白血病細(xì)胞的增殖。也有研究表明蜂膠通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。

Nup98基因位于11p15.5，編碼98 kD的核孔蛋白，位于細(xì)胞核的膜內(nèi)側(cè)及細(xì)胞核內(nèi)。主要參與調(diào)節(jié)核內(nèi)外蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。其N末端FG重復(fù)序列的異常與白血病發(fā)病關(guān)系密切，在許多急性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病急變期患者可檢測到與nup98有關(guān)的染色體易位、融合基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前認(rèn)為nup98－HOX融合基因的形成是白血病發(fā)病的重要原因。Kasper等[10]發(fā)現(xiàn) Nup98 N末端FG重復(fù)序列與CBP/P300結(jié)合起轉(zhuǎn)錄激活作用。也有人推測融合蛋白通過引起核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的缺陷而導(dǎo)致白血病的發(fā)生。還有研究提示Nup 98協(xié)同蛋白RAE－1(retinoic acid early inducible－1，視黃酸可誘導(dǎo)蛋白1)功能紊亂在白血病發(fā)生中可能發(fā)揮一定作用。

為探討蜂膠抑制白血病增殖的作用機(jī)制，本研究檢測了不同濃度蜂膠作用K562細(xì)胞后Nup98表達(dá)的情況。結(jié)果提示，在抑制K562細(xì)胞增殖的過程中，Nup98的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均有下調(diào)，提示Nup98表達(dá)下調(diào)參與了蜂膠抑制K562細(xì)胞增殖的過程。但Nup98下調(diào)后通過何種信號途徑引起增殖抑制，需要我們下一步進(jìn)行探索。

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[3]張?jiān)葡?，陳文峰，王家富，?蜂膠水提物對血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志，2010，26(12):2311 －2315.

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