張 磊, 趙翠芬△, 李福海, 王 榮, 夏 偉
(山東大學(xué)1齊魯醫(yī)院兒科,2衛(wèi)生部教育部心血管功能重塑與功能研究重點實驗室,山東濟(jì)南250012)
肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)肥大、增殖,膠原等細(xì)胞外間質(zhì)在肺血管壁沉積導(dǎo)致肺血管壁增厚、管腔狹窄是肺血管重構(gòu)主要的病理生理改變之一[1]。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)是一種血管活性多肽,ADM前體(proadrenomedullin,proADM)在體內(nèi)經(jīng)內(nèi)源性肽酶的作用可以降解產(chǎn)生4個不同的活性肽段,各肽段在肺內(nèi)的分布和作用不同[2],其中ADM可擴(kuò)血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移,腎上腺加壓素(adrenotensin,ADT)可收縮血管、升高血壓和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是各種刺激引起細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的共同通路,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)參與了高肺血流大鼠肺血管重構(gòu)的形成過程[4]。本研究探討ADM和ADT對培養(yǎng)的Wistar大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原合成及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表達(dá)的影響,揭示ADM和ADT調(diào)節(jié)PASMCs增殖的可能機(jī)制。
1.1 儀器和試劑 4周齡雄性Wistar大鼠(重約100 g),購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。山羊抗小鼠-TRITC和山羊抗小鼠-FITC(Sigma),小鼠抗人平滑肌α-actin單克隆抗體(R&D),ADM和ADT(北京中杉),兔抗大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原抗體和兔抗大鼠p-ERK1/2抗體(北京博奧森)。實驗用儀器、設(shè)備及其它試劑均由山東大學(xué)教育部和衛(wèi)生部心血管重構(gòu)與功能研究重點實驗室提供。
1.2 試劑配制 D-Hanks平衡鹽溶液:稱取 KCl 0.4 g、KH2PO40.06 g、NaCl 8.0 g、NaHCO30.35 g、Na2HPO4·12H2O 0.134 g和酚紅0.01 g溶解于三蒸水1 000 mL中,調(diào)pH值至7.2-7.4,過濾除菌,分裝后4℃保存。PBS緩沖液:稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4·7H2O 和 0.2 g KH2PO4溶解于1 000 mL三蒸水中,調(diào)pH值至7.3,過濾除菌,分裝后4℃保存。以上試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。培養(yǎng)基:80%高糖D MEM和10%FBS、10%G418過濾除菌。
2.1 大鼠PASMCs分離及培養(yǎng) 采用組織貼塊法培養(yǎng)雄性Wistar大鼠PASMCs,2%戊巴比妥麻醉(40 mg/kg),75%乙醇浸泡3 min,開胸取心肺,PBS沖洗2遍;在超凈臺內(nèi)用顯微剪及顯微鑷循肺動脈主干逐級追入肺實質(zhì),取肺動脈2級以下分支,冷PBS清洗2遍。冷PBS液中剝除外膜纖維脂肪層,縱向剪開血管,內(nèi)面朝上彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜,留中膜平滑肌層。用眼科剪將中膜剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊;用彎頭吸管將小組織塊移入50 mL培養(yǎng)瓶中,并均勻鋪于培養(yǎng)瓶底,每瓶25-30個組織塊;小心加入含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基5 mL,倒置于CO2孵箱中3-6 h,待組織塊貼壁牢固后,翻正培養(yǎng)瓶使組織塊完全浸泡于培養(yǎng)液中;放入CO2孵箱(37℃、5%CO2、95%空氣,保持一定濕度)繼續(xù)培養(yǎng)4-7 d后,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。待原代細(xì)胞生長至匯合狀態(tài)、鋪滿瓶壁的80%以上時,進(jìn)行傳代。實驗用4-7代平滑肌細(xì)胞。
2.2 PASMCs免疫熒光鑒定 采用平滑肌α-actin單克隆抗體對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將第4代的細(xì)胞消化后移入6孔板,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。按說明書進(jìn)行操作,分別加入小鼠抗人血管平滑肌細(xì)胞單克隆抗體(1∶500),0.01 mol/L PBS作陰性對照,滴加TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶500)孵育30 min 37℃ 濕盒;DAPI染細(xì)胞核1-2 min;防淬滅封片,鏡下觀察。
2.3 免疫熒光檢測ADM和ADT對大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2表達(dá)的影響 取4-7代PASMCs,酸處理蓋玻片放入6孔板內(nèi)做細(xì)胞爬片,分別加入:10-7mol/L ADM或ADT和兔抗Ⅰ型膠原抗體(1∶200);10-7mol/L ADM或ADT和兔抗Ⅲ型膠原抗體(1∶200);10-7mol/L ADM或ADT和兔抗p-ERK1/2抗體(1∶100);10-7mol/L ADM 或 ADT和0.01 mol/L PBS作陰性對照。滴加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶100),37℃孵育30 min。每組10孔,培養(yǎng)72 h,4%多聚甲醛固定,作免疫熒光分析,每張爬片在熒光顯微鏡下(×400)隨機(jī)選取5個視野拍照,觀察細(xì)胞漿出現(xiàn)綠色顆粒者為陽性細(xì)胞。采用Image-Pro Plus 5.0圖像處理軟件對結(jié)果進(jìn)行圖像分析處理,分析相同曝光時間下的吸光度(absorbance,A)值。
2.4 細(xì)胞總蛋白提取和免疫印跡 采用Western blotting檢測不同濃度的ADM和ADT對培養(yǎng)細(xì)胞之p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響:以下操作均在冰上或4°C進(jìn)行,所有液體預(yù)先致冷。分別加入 10-7mol/L、10-8mol/L 和 10-9mol/L ADM或ADT,培養(yǎng)到規(guī)定時點收集細(xì)胞(貼壁細(xì)胞胰酶消化),用PBS洗滌細(xì)胞2次,并轉(zhuǎn)移入EP管,1 000 r/min離心5 min棄盡上清液;將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞裂解液,冰浴40 min;18 000 r/min離心10 min,收集上清,即為細(xì)胞總蛋白。取20 μL總蛋白先經(jīng)12%SDS-PAGE分離,再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 (Amersham Pharmacia)上,用含0.05%Tween-20、5%脫脂奶粉的Tris緩沖液(TBS-T,5%non-fat milk)將膜室溫封閉2 h后,加入相應(yīng)的第Ⅰ抗體,4℃孵育過夜。用TBS-T洗膜3次,每次10 min。然后,將膜用相應(yīng)第Ⅱ抗體室溫孵育2 h。TBS-T洗膜3次,每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色,壓片、曝光、顯影、定影后晾干保存。采用Image-Pro Plus 5.0圖像處理軟件對結(jié)果進(jìn)行圖像分析處理,分析相同曝光時間下的A值。
細(xì)胞培養(yǎng)3-5 d后,用相差顯微鏡觀察見細(xì)胞呈梭形或長梭形排列,然后細(xì)胞呈放射性生長,多為兩極,胞漿均勻,可見圓形細(xì)胞核及分裂相。培養(yǎng)至7-10 d出現(xiàn)局部成束的細(xì)胞平行排列,部分區(qū)域細(xì)胞重疊,部分區(qū)域高低起伏呈“峰-谷”狀生長。用小鼠抗人α-actin抗體及TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體鑒定為平滑肌細(xì)胞,見圖1。細(xì)胞質(zhì)發(fā)紅色熒光(A1),細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光(A2),A3為A1和A2合成圖。細(xì)胞純度平均達(dá)97%以上。
Figure 1.Immunofluorescence identification of rat PASMCs(inverted phase-contrast microscope,×200).A1:cell cytoplasm was stained with TRITC shown in red;A2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;A3:overlap of A1 and A2.圖1 大鼠PASMCs免疫熒光
2.1 10-7mol/L ADM和ADT對PASMCsⅠ型膠原表達(dá)的影響 圖2中細(xì)胞質(zhì)圖B1發(fā)暗綠色、圖C1發(fā)亮綠色熒光,細(xì)胞核(B2、C2)發(fā)藍(lán)色熒光,B3、C3為合成圖。這提示:ADM可抑制培養(yǎng) PASMCsⅠ型膠原的表達(dá)。而 ADT可增強(qiáng)PASMCsⅠ型膠原表達(dá)。
2.2 10-7mol/L ADM和ADT對PASMCsⅢ型膠原表達(dá)的影響 圖3中細(xì)胞質(zhì)圖D1發(fā)暗綠色熒光、圖E1發(fā)亮綠色熒光,細(xì)胞核(D2、E2)發(fā)藍(lán)色熒光,D3、E3為合成圖。這提示:ADM可抑制PASMCsⅢ型膠原的表達(dá);ADT可增強(qiáng)培養(yǎng)PASMCsⅢ型膠原的表達(dá)。
2.3 10-7mol/L ADM 和 ADT對 PASMCs p-ERK1/2表達(dá)的影響 圖4中細(xì)胞質(zhì)圖F1發(fā)暗綠色熒光、圖G1發(fā)亮綠色熒光,細(xì)胞核(F2、G2)發(fā)藍(lán)色熒光,F(xiàn)3、G3為合成圖。這提示:ADM可抑制PASMCs p-ERK1/2的表達(dá),而ADT可增強(qiáng)培養(yǎng)PASMCs之p-ERK1/2的表達(dá)。
2.4 吸光度比值分析 10-7mol/L ADM和 ADT對大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2表達(dá)的影響 從表1中看出:吸光度比值顯示ADM可抑制培養(yǎng)PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2表達(dá)(P<0.05,P<0.01),而 ADT可增強(qiáng)PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及 p-ERK1/2表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。這提示 ADM對PASMCs膠原合成有促進(jìn)作用,而ADT可抑制PASMCs膠原合成。
ADM可呈劑量依賴性抑制PASMCs p-ERK1/2蛋白表達(dá)(P<0.01,P<0.05);ADT也呈劑量依賴性促進(jìn)PASMCs p-ERK1/2蛋白表達(dá)(P<0.01,P<0.05),見圖5。這提示p-ERK1/2在PASMCs增殖過程中被激活,ADM和ADT可能通過ERK通路調(diào)節(jié)PASMCs增殖。
Figure 2.The effects of 10-7mol/L ADM(B1-3)and 10-7mol/L ADT(C1-3)on the expression of collagen typeⅠin cultured PASMCs(immunofluorescence staining,×400).B1 and C1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;B2 and C2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;B3:overlap of B1 and B2;C3:overlap of C1 and C2.圖2 10-7mol/L ADM和ADT對培養(yǎng)PASMCsⅠ型膠原表達(dá)的影響
Figure 3.The effects of 10-7mol/L ADM(D1-3)and 10-7mol/L ADT(E1-3)on the expression of collagen typeⅢ in cultured PASMCs(immunofluorescence staining,×400).D1 and E1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;D2 and E2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;D3:overlap of D1 and D2;E3:overlap of E1 and D2.圖3 10-7mol/L ADM和ADT對培養(yǎng)PASMCsⅢ型膠原表達(dá)的影響
Figure 4.The effects of 10-7mol/L ADM(F1-3)and 10-7mol/L ADT(G1-3)on the expression of p-ERK1/2 in cultured PASMCs(immunofluorescence staining,×400).F1 and G1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;F2 and G2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;F3:overlap of F1 and F2;G3:overlap of G1 and G2.圖4 10-7mol/L ADM和ADT對培養(yǎng)PASMCs p-ERK1/2表達(dá)的影響
表1 10-7mol/L ADM和ADT對培養(yǎng)PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原和p-ERK1/2表達(dá)的影響Table 1.The effects of 10-7mol/L ADM and ADT on the expression of collagen typeⅠ,Ⅲ and p-ERK1/2 in cultured PASMCs(A.±s.n=10)
表1 10-7mol/L ADM和ADT對培養(yǎng)PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原和p-ERK1/2表達(dá)的影響Table 1.The effects of 10-7mol/L ADM and ADT on the expression of collagen typeⅠ,Ⅲ and p-ERK1/2 in cultured PASMCs(A.±s.n=10)
*P <0.05,**P <0.01 vs control.
Group Collagen typeⅠ Collagen typeⅢp-ERK1/2 ADM 0.713±0.030** 0.514±0.020** 0.912±0.040**ADT 1.210±0.020* 1.015±0.030* 1.414±0.030*Control 1.002±0.040 0.812±0.040 1.214±0.040
膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,血管壁主要存在Ⅰ、Ⅲ型膠原,Ⅰ型膠原與血管壁抗張力有關(guān),Ⅲ型膠原與血管壁彈性有關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)增加是肺動脈高壓和肺血管重構(gòu)的重要病理生理改變之一,血管壁中膠原蛋白堆積可導(dǎo)致肺動脈管壁增厚、管腔縮小,從而在缺氧性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)形成中起著十分重要的作用[5]。
Figure 5.Western blotting detected the effects of different concentrations of ADM(A)or ADT(B)on the protein expression of p-ERK1/2 in cultured rat PASMCs.β - actin served as internal control.Absorbance data were shown in C and D,respectively.ADM1,ADM2 and ADM3:10 -7mol/L,10 -8mol/L and 10 -9mol/L ADM;ADT1,ADT2 and ADT3:10-7mol/L,10-8mol/L and 10-9mol/L ADT.±s.n=6.*P<0.05,**P <0.01 vs control.圖5 Western blotting檢測不同濃度的ADM或ADT對大鼠PASMCs p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響
本研究采用貼塊法原代體外培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs[6],雖然培養(yǎng)周期較長,但方法簡單、經(jīng)濟(jì),生長狀態(tài)良好,經(jīng)傳代后可獲得較多的細(xì)胞數(shù)量,經(jīng)小鼠抗人平滑肌α-actin單克隆抗體對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定其細(xì)胞純度達(dá)97%。幼齡大鼠原代培養(yǎng)成功率高,但血管小,血管壁薄,細(xì)胞分離難度大,而老齡大鼠的細(xì)胞活力弱,生長緩慢,不適合細(xì)胞傳代生長,故實驗選擇4周齡、健康雄性大鼠。肺血管重構(gòu)主要發(fā)生于遠(yuǎn)端肺小動脈,表現(xiàn)為肺小動脈平滑肌細(xì)胞增殖、中膜增厚、無肌型肺小動脈肌化、微血栓形成、管腔狹窄等,故本研究選擇大鼠遠(yuǎn)端PASMCs進(jìn)行培養(yǎng)。
ADM是具有擴(kuò)血管、抗細(xì)胞增殖和遷移作用的血管活性多肽,以旁分泌和自分泌形式參與許多生理和病理過程。ADT可抑制ADM的血管活性,顯示縮血管和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖作用。研究證實ADM與ADT均參與了缺氧性肺血管重構(gòu)過程[7]。新近動物實驗研究發(fā)現(xiàn)ADM既可延緩肺血管重構(gòu),又能逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu),顯示了令人鼓舞的實驗效果[8]。
本研究結(jié)果顯示培養(yǎng)的PASMCs給予ADM刺激后,其胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較對照組均減弱,而給予ADT刺激后PASMCs胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較對照組增強(qiáng)。提示ADM可抑制培養(yǎng)的 PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原的合成。推測ADM可能通過抑制PASMCs增殖,使細(xì)胞數(shù)量減少;從基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制了PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá),下調(diào)了每個PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白合成的水平,導(dǎo)致膠原合成減少。膠原纖維是細(xì)胞質(zhì)的基質(zhì)成分之一,研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞中加入ADM可降低細(xì)胞遷移,抑制微管過度聚集,對抗胞質(zhì)骨架過度穩(wěn)定,從而延緩或抑制SMCs的肥大、增殖和遷移[9]。ADM還可能通過對PASMCs細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的表達(dá)和蛋白合成的調(diào)節(jié)作用來降低細(xì)胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。另外ADM可激活平滑肌細(xì)胞陽離子通道而使細(xì)胞超極化,細(xì)胞內(nèi)鈣水平降低;同時可活化磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B/Akt,使eNOS磷酸化而使其活性增強(qiáng),PASMCs收縮力降低,延緩細(xì)胞肥大,減少膠原等細(xì)胞基質(zhì)分泌[10]。ADM基因修飾的內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄到肺動脈高壓大鼠肺組織中可明顯降低肺動脈壓力,抑制平滑肌細(xì)胞重構(gòu)[11]。研究還證實ADM吸入或靜脈注射均能降低肺動脈高壓病人的肺動脈壓力和肺血管阻力,逆轉(zhuǎn)肺血管肥厚[12]。ADT則可能從基因轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá),上調(diào)了每個細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成水平,減緩了PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白的降解,從而使培養(yǎng)的大鼠PASMCs內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增加。
MAPKs通路為多種細(xì)胞外信號從細(xì)胞表面受體傳向細(xì)胞內(nèi)的一條重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。已被完全證實的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有3條:應(yīng)力活化蛋白激酶(SAPK)、ERK和甘油高滲性激酶(HOG1)[13]。ERK與細(xì)胞增殖反應(yīng)有關(guān),許多促增殖活性物質(zhì),分別通過激活受體酪氨酸激酶和G蛋白途徑,相繼引起Ras、MAPK激酶激活,后者激活轉(zhuǎn)錄因子、刺激與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化與增殖[14]。研究已證實MAPK在VSMCs增殖、分化、凋亡、細(xì)胞骨架等重構(gòu)及細(xì)胞周期中起著非常重要的作用,MAPK可激活轉(zhuǎn)錄因子,增加PASMCs的DNA合成,促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[15]。
本研究結(jié)果顯示ADM可抑制培養(yǎng)的PASMCs p-ERK1/2表達(dá);而 ADT促進(jìn)培養(yǎng)的 PASMCs內(nèi)p-ERK1/2表達(dá),二者均隨濃度增加作用增強(qiáng)。提示ERK/MAPK途徑在PASMCs增殖中被激活,激活的p-ERK1/2可通過核轉(zhuǎn)位,啟動并上調(diào)PASMCs增殖基因,最終導(dǎo)致PASMC增殖。ADM具有抑制細(xì)胞增殖作用,ADM可以與特異性受體相結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)cAMP升高,通過cAMP或cGMP的介導(dǎo)而抑制細(xì)胞增殖[16];ADM還可能通過直接抑制 ERK/MAPK信號通路,切斷信號通路下游與增殖有關(guān)的激酶,抑制轉(zhuǎn)錄因子功能,從而抑制細(xì)胞分化、增殖[17]。ADT可能通過激活ERK/MAPK信號通路,激活信號通路下游與增殖有關(guān)的激酶,增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子功能,增強(qiáng)細(xì)胞分化與增殖。
總之,本研究通過原代培養(yǎng)Wistar大鼠PASMCs,檢測ADM和ADT對PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原合成及p-ERK1/2表達(dá)的影響,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADM可促進(jìn)PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2的表達(dá),而ADT可抑制PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2的表達(dá)。推測ERK信號途徑在PASMCs增殖過程中被激活,ADM和ADT可能通過ERK途徑調(diào)節(jié)PASMCs增殖。ADM或ADT拮抗劑估計可延緩或阻抑肺動脈高壓和肺血管重構(gòu)的形成和發(fā)展。
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