張 磊， 趙翠芬△， 李福海， 王 榮， 夏 偉

(山東大學(xué)1齊魯醫(yī)院兒科，2衛(wèi)生部教育部心血管功能重塑與功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250012)

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)肥大、增殖，膠原等細(xì)胞外間質(zhì)在肺血管壁沉積導(dǎo)致肺血管壁增厚、管腔狹窄是肺血管重構(gòu)主要的病理生理改變之一[1]。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)是一種血管活性多肽，ADM前體(proadrenomedullin，proADM)在體內(nèi)經(jīng)內(nèi)源性肽酶的作用可以降解產(chǎn)生4個(gè)不同的活性肽段，各肽段在肺內(nèi)的分布和作用不同[2]，其中ADM可擴(kuò)血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，腎上腺加壓素(adrenotensin，ADT)可收縮血管、升高血壓和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)是各種刺激引起細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的共同通路，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)參與了高肺血流大鼠肺血管重構(gòu)的形成過程[4]。本研究探討ADM和ADT對(duì)培養(yǎng)的Wistar大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原合成及磷酸化ERK1/2(p－ERK1/2)表達(dá)的影響，揭示ADM和ADT調(diào)節(jié)PASMCs增殖的可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 儀器和試劑 4周齡雄性Wistar大鼠(重約100 g)，購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。山羊抗小鼠－TRITC和山羊抗小鼠－FITC(Sigma)，小鼠抗人平滑肌α－actin單克隆抗體(R＆D)，ADM和ADT(北京中杉)，兔抗大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原抗體和兔抗大鼠p－ERK1/2抗體(北京博奧森)。實(shí)驗(yàn)用儀器、設(shè)備及其它試劑均由山東大學(xué)教育部和衛(wèi)生部心血管重構(gòu)與功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑配制 D－Hanks平衡鹽溶液:稱取 KCl 0.4 g、KH2PO40.06 g、NaCl 8.0 g、NaHCO30.35 g、Na2HPO4·12H2O 0.134 g和酚紅0.01 g溶解于三蒸水1 000 mL中，調(diào)pH值至7.2－7.4，過濾除菌，分裝后4℃保存。PBS緩沖液:稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4·7H2O 和 0.2 g KH2PO4溶解于1 000 mL三蒸水中，調(diào)pH值至7.3，過濾除菌，分裝后4℃保存。以上試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。培養(yǎng)基:80%高糖D MEM和10%FBS、10%G418過濾除菌。

2 方法

2.1 大鼠PASMCs分離及培養(yǎng) 采用組織貼塊法培養(yǎng)雄性Wistar大鼠PASMCs，2%戊巴比妥麻醉(40 mg/kg)，75%乙醇浸泡3 min，開胸取心肺，PBS沖洗2遍;在超凈臺(tái)內(nèi)用顯微剪及顯微鑷循肺動(dòng)脈主干逐級(jí)追入肺實(shí)質(zhì)，取肺動(dòng)脈2級(jí)以下分支，冷PBS清洗2遍。冷PBS液中剝除外膜纖維脂肪層，縱向剪開血管，內(nèi)面朝上彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜，留中膜平滑肌層。用眼科剪將中膜剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊;用彎頭吸管將小組織塊移入50 mL培養(yǎng)瓶中，并均勻鋪于培養(yǎng)瓶底，每瓶25－30個(gè)組織塊;小心加入含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基5 mL，倒置于CO2孵箱中3－6 h，待組織塊貼壁牢固后，翻正培養(yǎng)瓶使組織塊完全浸泡于培養(yǎng)液中;放入CO2孵箱(37℃、5%CO2、95%空氣，保持一定濕度)繼續(xù)培養(yǎng)4－7 d后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。待原代細(xì)胞生長至匯合狀態(tài)、鋪滿瓶壁的80%以上時(shí)，進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)用4－7代平滑肌細(xì)胞。

2.2 PASMCs免疫熒光鑒定 采用平滑肌α－actin單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將第4代的細(xì)胞消化后移入6孔板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。按說明書進(jìn)行操作，分別加入小鼠抗人血管平滑肌細(xì)胞單克隆抗體(1∶500)，0.01 mol/L PBS作陰性對(duì)照，滴加TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶500)孵育30 min 37℃ 濕盒;DAPI染細(xì)胞核1－2 min;防淬滅封片，鏡下觀察。

2.3 免疫熒光檢測(cè)ADM和ADT對(duì)大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達(dá)的影響 取4－7代PASMCs，酸處理蓋玻片放入6孔板內(nèi)做細(xì)胞爬片，分別加入:10－7mol/L ADM或ADT和兔抗Ⅰ型膠原抗體(1∶200);10－7mol/L ADM或ADT和兔抗Ⅲ型膠原抗體(1∶200);10－7mol/L ADM或ADT和兔抗p－ERK1/2抗體(1∶100);10－7mol/L ADM 或 ADT和0.01 mol/L PBS作陰性對(duì)照。滴加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶100)，37℃孵育30 min。每組10孔，培養(yǎng)72 h，4%多聚甲醛固定，作免疫熒光分析，每張爬片在熒光顯微鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，觀察細(xì)胞漿出現(xiàn)綠色顆粒者為陽性細(xì)胞。采用Image－Pro Plus 5.0圖像處理軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析處理，分析相同曝光時(shí)間下的吸光度(absorbance，A)值。

2.4 細(xì)胞總蛋白提取和免疫印跡 采用Western blotting檢測(cè)不同濃度的ADM和ADT對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞之p－ERK1/2蛋白表達(dá)的影響:以下操作均在冰上或4°C進(jìn)行，所有液體預(yù)先致冷。分別加入 10－7mol/L、10－8mol/L 和 10－9mol/L ADM或ADT，培養(yǎng)到規(guī)定時(shí)點(diǎn)收集細(xì)胞(貼壁細(xì)胞胰酶消化)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，并轉(zhuǎn)移入EP管，1 000 r/min離心5 min棄盡上清液;將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞裂解液，冰浴40 min;18 000 r/min離心10 min，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。取20 μL總蛋白先經(jīng)12%SDS－PAGE分離，再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 (Amersham Pharmacia)上，用含0.05%Tween－20、5%脫脂奶粉的Tris緩沖液(TBS－T，5%non－fat milk)將膜室溫封閉2 h后，加入相應(yīng)的第Ⅰ抗體，4℃孵育過夜。用TBS－T洗膜3次，每次10 min。然后，將膜用相應(yīng)第Ⅱ抗體室溫孵育2 h。TBS－T洗膜3次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，壓片、曝光、顯影、定影后晾干保存。采用Image－Pro Plus 5.0圖像處理軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析處理，分析相同曝光時(shí)間下的A值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)3－5 d后，用相差顯微鏡觀察見細(xì)胞呈梭形或長梭形排列，然后細(xì)胞呈放射性生長，多為兩極，胞漿均勻，可見圓形細(xì)胞核及分裂相。培養(yǎng)至7－10 d出現(xiàn)局部成束的細(xì)胞平行排列，部分區(qū)域細(xì)胞重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰－谷”狀生長。用小鼠抗人α－actin抗體及TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體鑒定為平滑肌細(xì)胞，見圖1。細(xì)胞質(zhì)發(fā)紅色熒光(A1)，細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光(A2)，A3為A1和A2合成圖。細(xì)胞純度平均達(dá)97%以上。

Figure 1.Immunofluorescence identification of rat PASMCs(inverted phase－contrast microscope，×200).A1:cell cytoplasm was stained with TRITC shown in red;A2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;A3:overlap of A1 and A2.圖1 大鼠PASMCs免疫熒光

2 免疫熒光檢測(cè)ADM和ADT對(duì)大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達(dá)的影響

2.1 10－7mol/L ADM和ADT對(duì)PASMCsⅠ型膠原表達(dá)的影響 圖2中細(xì)胞質(zhì)圖B1發(fā)暗綠色、圖C1發(fā)亮綠色熒光，細(xì)胞核(B2、C2)發(fā)藍(lán)色熒光，B3、C3為合成圖。這提示:ADM可抑制培養(yǎng) PASMCsⅠ型膠原的表達(dá)。而 ADT可增強(qiáng)PASMCsⅠ型膠原表達(dá)。

2.2 10－7mol/L ADM和ADT對(duì)PASMCsⅢ型膠原表達(dá)的影響 圖3中細(xì)胞質(zhì)圖D1發(fā)暗綠色熒光、圖E1發(fā)亮綠色熒光，細(xì)胞核(D2、E2)發(fā)藍(lán)色熒光，D3、E3為合成圖。這提示:ADM可抑制PASMCsⅢ型膠原的表達(dá);ADT可增強(qiáng)培養(yǎng)PASMCsⅢ型膠原的表達(dá)。

2.3 10－7mol/L ADM 和 ADT對(duì) PASMCs p－ERK1/2表達(dá)的影響 圖4中細(xì)胞質(zhì)圖F1發(fā)暗綠色熒光、圖G1發(fā)亮綠色熒光，細(xì)胞核(F2、G2)發(fā)藍(lán)色熒光，F(xiàn)3、G3為合成圖。這提示:ADM可抑制PASMCs p－ERK1/2的表達(dá)，而ADT可增強(qiáng)培養(yǎng)PASMCs之p－ERK1/2的表達(dá)。

2.4 吸光度比值分析 10－7mol/L ADM和 ADT對(duì)大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達(dá)的影響 從表1中看出:吸光度比值顯示ADM可抑制培養(yǎng)PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，而 ADT可增強(qiáng)PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及 p－ERK1/2表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)。這提示 ADM對(duì)PASMCs膠原合成有促進(jìn)作用，而ADT可抑制PASMCs膠原合成。

3 Western blotting檢測(cè)ADM和ADT對(duì)PASMCs p－ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

ADM可呈劑量依賴性抑制PASMCs p－ERK1/2蛋白表達(dá)(P＜0.01，P＜0.05);ADT也呈劑量依賴性促進(jìn)PASMCs p－ERK1/2蛋白表達(dá)(P＜0.01，P＜0.05)，見圖5。這提示p－ERK1/2在PASMCs增殖過程中被激活，ADM和ADT可能通過ERK通路調(diào)節(jié)PASMCs增殖。

Figure 2.The effects of 10－7mol/L ADM(B1－3)and 10－7mol/L ADT(C1－3)on the expression of collagen typeⅠin cultured PASMCs(immunofluorescence staining，×400).B1 and C1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;B2 and C2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;B3:overlap of B1 and B2;C3:overlap of C1 and C2.圖2 10－7mol/L ADM和ADT對(duì)培養(yǎng)PASMCsⅠ型膠原表達(dá)的影響

Figure 3.The effects of 10－7mol/L ADM(D1－3)and 10－7mol/L ADT(E1－3)on the expression of collagen typeⅢ in cultured PASMCs(immunofluorescence staining，×400).D1 and E1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;D2 and E2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;D3:overlap of D1 and D2;E3:overlap of E1 and D2.圖3 10－7mol/L ADM和ADT對(duì)培養(yǎng)PASMCsⅢ型膠原表達(dá)的影響

Figure 4.The effects of 10－7mol/L ADM(F1－3)and 10－7mol/L ADT(G1－3)on the expression of p－ERK1/2 in cultured PASMCs(immunofluorescence staining，×400).F1 and G1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;F2 and G2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;F3:overlap of F1 and F2;G3:overlap of G1 and G2.圖4 10－7mol/L ADM和ADT對(duì)培養(yǎng)PASMCs p－ERK1/2表達(dá)的影響

表1 10－7mol/L ADM和ADT對(duì)培養(yǎng)PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原和p－ERK1/2表達(dá)的影響Table 1.The effects of 10－7mol/L ADM and ADT on the expression of collagen typeⅠ，Ⅲ and p－ERK1/2 in cultured PASMCs(A.±s.n=10)

表1 10－7mol/L ADM和ADT對(duì)培養(yǎng)PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原和p－ERK1/2表達(dá)的影響Table 1.The effects of 10－7mol/L ADM and ADT on the expression of collagen typeⅠ，Ⅲ and p－ERK1/2 in cultured PASMCs(A.±s.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

Group Collagen typeⅠ Collagen typeⅢp－ERK1/2 ADM 0.713±0.030＊＊ 0.514±0.020＊＊ 0.912±0.040＊＊ADT 1.210±0.020* 1.015±0.030* 1.414±0.030*Control 1.002±0.040 0.812±0.040 1.214±0.040

討 論

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，血管壁主要存在Ⅰ、Ⅲ型膠原，Ⅰ型膠原與血管壁抗張力有關(guān)，Ⅲ型膠原與血管壁彈性有關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)增加是肺動(dòng)脈高壓和肺血管重構(gòu)的重要病理生理改變之一，血管壁中膠原蛋白堆積可導(dǎo)致肺動(dòng)脈管壁增厚、管腔縮小，從而在缺氧性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)形成中起著十分重要的作用[5]。

Figure 5.Western blotting detected the effects of different concentrations of ADM(A)or ADT(B)on the protein expression of p－ERK1/2 in cultured rat PASMCs.β － actin served as internal control.Absorbance data were shown in C and D，respectively.ADM1，ADM2 and ADM3:10 －7mol/L，10 －8mol/L and 10 －9mol/L ADM;ADT1，ADT2 and ADT3:10－7mol/L，10－8mol/L and 10－9mol/L ADT.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 Western blotting檢測(cè)不同濃度的ADM或ADT對(duì)大鼠PASMCs p－ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

本研究采用貼塊法原代體外培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs[6]，雖然培養(yǎng)周期較長，但方法簡單、經(jīng)濟(jì)，生長狀態(tài)良好，經(jīng)傳代后可獲得較多的細(xì)胞數(shù)量，經(jīng)小鼠抗人平滑肌α－actin單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定其細(xì)胞純度達(dá)97%。幼齡大鼠原代培養(yǎng)成功率高，但血管小，血管壁薄，細(xì)胞分離難度大，而老齡大鼠的細(xì)胞活力弱，生長緩慢，不適合細(xì)胞傳代生長，故實(shí)驗(yàn)選擇4周齡、健康雄性大鼠。肺血管重構(gòu)主要發(fā)生于遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈，表現(xiàn)為肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、中膜增厚、無肌型肺小動(dòng)脈肌化、微血栓形成、管腔狹窄等，故本研究選擇大鼠遠(yuǎn)端PASMCs進(jìn)行培養(yǎng)。

ADM是具有擴(kuò)血管、抗細(xì)胞增殖和遷移作用的血管活性多肽，以旁分泌和自分泌形式參與許多生理和病理過程。ADT可抑制ADM的血管活性，顯示縮血管和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖作用。研究證實(shí)ADM與ADT均參與了缺氧性肺血管重構(gòu)過程[7]。新近動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ADM既可延緩肺血管重構(gòu)，又能逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，顯示了令人鼓舞的實(shí)驗(yàn)效果[8]。

本研究結(jié)果顯示培養(yǎng)的PASMCs給予ADM刺激后，其胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較對(duì)照組均減弱，而給予ADT刺激后PASMCs胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)。提示ADM可抑制培養(yǎng)的 PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原的合成。推測(cè)ADM可能通過抑制PASMCs增殖，使細(xì)胞數(shù)量減少;從基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制了PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，下調(diào)了每個(gè)PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白合成的水平，導(dǎo)致膠原合成減少。膠原纖維是細(xì)胞質(zhì)的基質(zhì)成分之一，研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞中加入ADM可降低細(xì)胞遷移，抑制微管過度聚集，對(duì)抗胞質(zhì)骨架過度穩(wěn)定，從而延緩或抑制SMCs的肥大、增殖和遷移[9]。ADM還可能通過對(duì)PASMCs細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的表達(dá)和蛋白合成的調(diào)節(jié)作用來降低細(xì)胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。另外ADM可激活平滑肌細(xì)胞陽離子通道而使細(xì)胞超極化，細(xì)胞內(nèi)鈣水平降低;同時(shí)可活化磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B/Akt，使eNOS磷酸化而使其活性增強(qiáng)，PASMCs收縮力降低，延緩細(xì)胞肥大，減少膠原等細(xì)胞基質(zhì)分泌[10]。ADM基因修飾的內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄到肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中可明顯降低肺動(dòng)脈壓力，抑制平滑肌細(xì)胞重構(gòu)[11]。研究還證實(shí)ADM吸入或靜脈注射均能降低肺動(dòng)脈高壓病人的肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力，逆轉(zhuǎn)肺血管肥厚[12]。ADT則可能從基因轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，上調(diào)了每個(gè)細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成水平，減緩了PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白的降解，從而使培養(yǎng)的大鼠PASMCs內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增加。

MAPKs通路為多種細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳向細(xì)胞內(nèi)的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。已被完全證實(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有3條:應(yīng)力活化蛋白激酶(SAPK)、ERK和甘油高滲性激酶(HOG1)[13]。ERK與細(xì)胞增殖反應(yīng)有關(guān)，許多促增殖活性物質(zhì)，分別通過激活受體酪氨酸激酶和G蛋白途徑，相繼引起Ras、MAPK激酶激活，后者激活轉(zhuǎn)錄因子、刺激與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化與增殖[14]。研究已證實(shí)MAPK在VSMCs增殖、分化、凋亡、細(xì)胞骨架等重構(gòu)及細(xì)胞周期中起著非常重要的作用，MAPK可激活轉(zhuǎn)錄因子，增加PASMCs的DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[15]。

本研究結(jié)果顯示ADM可抑制培養(yǎng)的PASMCs p－ERK1/2表達(dá);而 ADT促進(jìn)培養(yǎng)的 PASMCs內(nèi)p－ERK1/2表達(dá)，二者均隨濃度增加作用增強(qiáng)。提示ERK/MAPK途徑在PASMCs增殖中被激活，激活的p－ERK1/2可通過核轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)并上調(diào)PASMCs增殖基因，最終導(dǎo)致PASMC增殖。ADM具有抑制細(xì)胞增殖作用，ADM可以與特異性受體相結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，通過cAMP或cGMP的介導(dǎo)而抑制細(xì)胞增殖[16];ADM還可能通過直接抑制 ERK/MAPK信號(hào)通路，切斷信號(hào)通路下游與增殖有關(guān)的激酶，抑制轉(zhuǎn)錄因子功能，從而抑制細(xì)胞分化、增殖[17]。ADT可能通過激活ERK/MAPK信號(hào)通路，激活信號(hào)通路下游與增殖有關(guān)的激酶，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子功能，增強(qiáng)細(xì)胞分化與增殖。

總之，本研究通過原代培養(yǎng)Wistar大鼠PASMCs，檢測(cè)ADM和ADT對(duì)PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原合成及p－ERK1/2表達(dá)的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADM可促進(jìn)PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2的表達(dá)，而ADT可抑制PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2的表達(dá)。推測(cè)ERK信號(hào)途徑在PASMCs增殖過程中被激活，ADM和ADT可能通過ERK途徑調(diào)節(jié)PASMCs增殖。ADM或ADT拮抗劑估計(jì)可延緩或阻抑肺動(dòng)脈高壓和肺血管重構(gòu)的形成和發(fā)展。

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