趙吉星， 魯建軍， 孫 磊， 羅紅鶴， 顧 勇

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東廣州510080)

Wip1(wild－type p53－induced phosphatase 1)，即野生型p53介導(dǎo)的蛋白磷酸酶，它與p53有著密切的關(guān)系[1，2]。Wip1在WMN(wt－p53)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，是一種核蛋白[3]。小鼠與人Wip1氨基酸序列同源性約為86%，在小鼠體內(nèi)各臟器中均檢測(cè)到該基因的表達(dá)，尤其在睪丸中表達(dá)量明顯增高，且在細(xì)胞減數(shù)分裂和胚芽分化過(guò)程中有重要作用[4]。p53基因是一種抑癌基因，在正常細(xì)胞受到各種應(yīng)激作用導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，p53基因被激活，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程。p53基因功能被抑制時(shí)，可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。是否Wip1可以抑制p53的功能而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?Wip1基因是一種原癌基因[5]。2004年 Bulavin等[6]對(duì) Wip1基因做了進(jìn)一步研究證明Wip1基因缺失可以抑制細(xì)胞的癌變。目前已經(jīng)證實(shí)在胰腺癌[7]、膀胱癌[8]、肝癌[9]、乳腺癌[10]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[11]、卵巢透明細(xì)胞癌[12]、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤[13]和胃癌[14]中Wip1高表達(dá)，通過(guò)抑制p53基因功能而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞DNA損傷激活A(yù)TM/ATR下游重要靶蛋白磷酸化，研究證實(shí)ATM/ATR啟動(dòng)的損傷修復(fù)對(duì)阻止腫瘤發(fā)生有重要意義[15]。高表達(dá)的Wip1可能通過(guò)降低ATM依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)活性，抑制DNA損傷的修復(fù)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[16]。DNA損傷時(shí)，ATM使Chk2磷酸化，阻止腫瘤的發(fā)生。而Wip1與Chk2結(jié)合使其去磷酸化使得Chk2失活，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Wip1也可以抑制Chk1磷酸化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[17]。

目前認(rèn)為Wip1至少通過(guò)4種機(jī)制抑制p53的活性:(1)直接作用于p53使其N端第15位氨基酸殘基去磷酸化而失活[18];(2)間接通過(guò)p38MAPK去磷酸化，使得下游p53蛋白的第33和46位絲氨酸殘基磷酸化過(guò)程受阻而失活[19];(3)通過(guò)Chk1去磷酸化后使得下游p53蛋白第20位絲氨酸殘基去磷酸化而失活[18];(4)通過(guò)p38MAPK去磷酸化途經(jīng)進(jìn)一步抑制p19 ARF蛋白表達(dá)，激活下游MDM2與p53的結(jié)合，從而使得p53轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能失活[6]。這4種機(jī)制當(dāng)中，p38 MAPK信號(hào)通路更成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。由 Wip1、p38 MAPK和p53形成的負(fù)反饋通路，在腫瘤的形成中發(fā)揮著重要作用[6]。在乳腺癌中也證明過(guò)表達(dá)的Wip1通過(guò)Wip1/p38 MAPK/p53信號(hào)通路使內(nèi)環(huán)境失調(diào)[20]。當(dāng)應(yīng)用 ATO阻滯Wip1的1條作用途徑Wip1－p38 MAPK－p53后，也可加劇白血病細(xì)胞的凋亡[21]。

本課題組的前期實(shí)驗(yàn)證明Wip1在肺癌細(xì)胞及組織中過(guò)表達(dá)[22]，而對(duì)Wip1在肺癌細(xì)胞中的作用途徑的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blotting檢測(cè)肺癌細(xì)胞中是否有Wip1－p38 MAPK－p53途徑的失衡，探討Wip1在肺癌中的作用機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞A549和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI－H460購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;人鱗癌細(xì)胞NCI－1299購(gòu)自廣州十環(huán)醫(yī)藥公司;人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE購(gòu)自湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司。

2 主要試劑

RPMI－1640培養(yǎng)基(Gibco);胰酶、PBS 、DMSO、BSA、脫脂奶粉、丙稀酰胺(廣州威佳);胎牛血清(Gibco);RIPA裂解液(上海申能博彩);苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF，Sigma);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天);Protein marker(MBI Fermentas);兔抗人 Wip1多克隆抗體(Santa Cruz);兔抗人p－p53(Ser46)單克隆抗體(Cell Signaling);兔抗人 p－p38 MAPK(Thr180/Tyr182)單克隆抗體(Cell Signaling);兔抗人p53單克隆抗體、兔抗人p38 MAPK單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG單抗(武漢博士德);SuperECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊);X－膠片(Kodak);其它未提及的化學(xué)試劑均為市售分析純。

3 方法

3.1 細(xì)胞株的復(fù)蘇、培養(yǎng)、凍存 從液氮罐中取出凍存管，置于37℃水中，不停搖動(dòng)以盡快解凍。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，加入10 mL RPMI－1640培養(yǎng)基，離心后去上清。加入2 mL RPMI－1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，另加入6 mL RPMI－1640培養(yǎng)基置CO2孵箱中培養(yǎng)。2－3 d更換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活的胎牛血清，并加入了1%谷氨酰胺及1%青霉素和鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液中，放置于37℃、飽和濕度、5%CO2的孵箱中孵育;每2－3 d換液1次;用消化液常規(guī)消化傳代。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞密度至80%時(shí)，收集細(xì)胞到離心管中，1 000 r/min離心10 min。棄上清，加入凍存液，輕吹打成均勻細(xì)胞懸液，移入凍存管中，4℃放置約30 min，－20℃放置約30 min，置－80℃冰箱，第2 d移入液氮長(zhǎng)期保存。

3.2 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Wip1－p38MAPK－p53通路蛋白的表達(dá) 總蛋白的提取，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，PBS洗滌2次。在細(xì)胞中加入RIPA裂解液(強(qiáng))，約每2×106個(gè)細(xì)胞加RIPA裂解液150 μL，并在臨用前加入PMSF，使其終濃度為1 mmol/L。在冰上裂解15 min，4℃、15 000 r/min離心30 min。取上清保存于－80℃冰箱中備用。取部分上清以BCA法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)節(jié)各組蛋白濃度。蛋白濃度測(cè)定，配制工作液:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量，將BCA reagent A∶BCA reagent B按50∶1的體積配制工作液，充分混合均勻。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及樣品:在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及雙蒸水，樣品稀釋10倍后每孔加入25 μL，然后在各孔內(nèi)加入200 μL工作液，混合均勻，37℃放置30 min。冷卻到室溫后，在紫外分光光度計(jì)上于595 nm處測(cè)定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的不同濃度為橫坐標(biāo)，每一濃度所對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線;從曲線上找出樣品蛋白質(zhì)所對(duì)應(yīng)吸光度值和濃度，該濃度乘以樣品的稀釋倍數(shù)即得樣品的原始濃度。蛋白質(zhì)SDS－PAGE電泳，制膠:將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，晾干。配制10%分離膠和5%濃縮膠。灌膠:將分離膠小心移入垂直電泳槽至2/3處。加入ddH2O壓膠。待分離膠凝固后小心移去ddH2O，灌制濃縮膠，插梳。上樣:灌好濃縮膠1 h后拔除梳子，撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔2遍以去除殘膠。取調(diào)定好濃度的蛋白加入5×上樣緩沖液煮沸5 min，然后加樣。電泳:垂直電泳的條件為濃縮膠100 V，分離膠200 V。電轉(zhuǎn)移，取膠:將膠卸下，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上3張濾紙、PVDF膜、凝膠、3張濾紙，注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過(guò)多部分。濕轉(zhuǎn):電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1 000 mL電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。將電泳槽置于冰水混合物中，電轉(zhuǎn)條件為110 min，200 mA。封閉:將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，TBST漂洗3次，每次10 min，浸沒(méi)于封閉液中緩慢搖蕩，4℃過(guò)夜。結(jié)合Ⅰ抗:將封閉好的膜放入含Ⅰ抗的封閉液中，室溫輕搖1.5 h。洗滌:Ⅰ抗孵育結(jié)束后，將PVDF膜從Ⅰ抗封閉液中取出，TBST洗3次，每次10 min。結(jié)合Ⅱ抗:將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG單抗封閉液中，室溫輕搖1 h。洗滌:Ⅱ抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜后再浸洗3次，每次10 min。發(fā)光鑒定，將膜上的液體控干，置于保鮮膜內(nèi)，將發(fā)光液A液和B液各500 μL混合后涂于膜上，反應(yīng)2 min。熄燈至可見(jiàn)淡綠色熒光條帶后，將保鮮膜固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見(jiàn)熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1－2 min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干。用凝膠分析軟件Image Quant 5.2對(duì)圖像進(jìn)行分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

Western bloting檢測(cè)Wip1蛋白的表達(dá)，用Wip1與內(nèi)參GAPDH的灰度比值表示表達(dá)量。Wip1蛋白在3種肺癌細(xì)胞和人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE中均有表達(dá)，人肺腺癌細(xì)胞A549、人鱗癌細(xì)胞NCI－1299和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460中的Wip1蛋白表達(dá)水平明顯高于HBE細(xì)胞，差異顯著(P＜0.05)。3種肺癌細(xì)胞和HBE細(xì)胞中p53蛋白和p38 MAPK蛋白的表達(dá)差異無(wú)顯著(P＞0.05);p－p38 MAPK蛋白和p－p53蛋白在HBE中的表達(dá)均高于3種肺癌細(xì)胞，差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖1、表1。結(jié)果提示肺癌細(xì)胞中存在Wip1－p38 MAPK －p53信號(hào)通路的失衡(Wip1表達(dá)增加，p－p38 MAPK和p－p53表達(dá)降低)。

Figure 1.Expression of Wip1－p38 MAPK－p53－related proteins in HBE and lung cancer cells detected by Western blotting.Lane 1:HBE cells;Lane 2:NCI－1299 cells;Lane 3:A549 cells;Lane 4:H460 cells.圖1 Western blotting檢測(cè)HBE及肺癌細(xì)胞中Wip1－p38 MAPK－p53通路蛋白的表達(dá)

討 論

Wip1基因是一種原癌基因，已證實(shí)在胰腺癌[7]、膀胱癌[8]、肝癌[9]、乳腺癌[10]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[11]、卵巢透明細(xì)胞癌[12]、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤[13]和胃癌[14]中 Wip1 高表達(dá)，通過(guò)抑制p53基因功能而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示:Wip1 mRNA在這些肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常支氣管上皮細(xì)胞，各種肺癌細(xì)胞類型中的表達(dá)無(wú)差異[22]。本實(shí)驗(yàn)中我們用Western blotting檢測(cè)了各類肺癌細(xì)胞中Wip1蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Wip1蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常支氣管上皮細(xì)胞，各種肺癌細(xì)胞類型中的表達(dá)無(wú)顯著差異，與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致，但表達(dá)的差異沒(méi)有mRNA那么大，可能存在著轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程。既然Wip1在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，那么在肺癌中Wip1主要是通過(guò)哪個(gè)途徑導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生呢?我們做了進(jìn)一步的探索。在4條已知Wip1作用途徑中，p38 MAPK是一個(gè)重要樞紐，我們重點(diǎn)關(guān)注了p38 MAPK信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞受到周圍環(huán)境的刺激如UV照射后，可使p38 MAPK磷酸化而活化，而活化后的p38 MAPK可磷酸化p53而提高其活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期的停止或細(xì)胞凋亡[23]。Wip1、p38 MAPK和p53通過(guò)形成一個(gè)負(fù)反饋通路，在腫瘤的形成中發(fā)揮著重要作用[6]。在乳腺癌組織中檢測(cè)到Wip1－p38 MAPK－p53信號(hào)通路的存在，并且腫瘤組織中高表達(dá)的Wip1通過(guò)Wip1－p38 MAPK－p53信號(hào)通路而使內(nèi)環(huán)境失調(diào)[20]。Takekawa等[24]提出 p53誘導(dǎo)的蛋白激酶Wip1調(diào)控著細(xì)胞在UV照射后Wip1－p38 MAPK－p53信號(hào)通路的負(fù)反饋。

表1 Wip1－p38 MAPK－p53通路蛋白的表達(dá)水平Table 1.Expression levels of Wip1－p38 MAPK－p53 proteins(±s.n=12)

表1 Wip1－p38 MAPK－p53通路蛋白的表達(dá)水平Table 1.Expression levels of Wip1－p38 MAPK－p53 proteins(±s.n=12)

*P ＜0.05 vs HBE cells.

Group HBE cells NCI－1299 cells A549 cells H460cells p53 1.00 ±0.13 1.10 ±0.20 1.17 ±0.16 1.17 ±0.17 p38 1.00 ±0.06 0.94 ±0.09 0.98 ±0.02 0.94 ±0.11 p－p53 1.01 ±0.01 0.82 ±0.02* 0.79 ±0.25* 0.81 ±0.02*p－p38 0.99 ±0.05 0.74 ±0.07* 0.77 ±0.05* 0.78 ±0.05*Wip－1 0.70 ±0.05 0.96 ±0.02* 0.92 ±0.03* 1.05 ±0.11*

本實(shí)驗(yàn)中 Western blotting檢測(cè)了 p53、p－p53(Ser46)、p38 MAPK和p－p38 MAPK(Thr180/Tyr182)在肺癌細(xì)胞和正常支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，在正常細(xì)胞中p53和p38 MAPK是通過(guò)磷酸化活化，進(jìn)而在各個(gè)生物效應(yīng)中起作用的。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞和正常支氣管上皮細(xì)胞中，總的p53和p38 MAPK表達(dá)沒(méi)有顯著差異，然而在肺癌細(xì)胞中活化的p－p38 MAPK和p－p53表達(dá)降低，這引起了細(xì)胞的一系列生物效應(yīng)功能的紊亂，可能導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，而且在肺癌細(xì)胞中均有Wip1表達(dá)增加，肺癌細(xì)胞中存在著Wip1－p38 MAPK－p53信號(hào)通路的失衡，提示這一信號(hào)通路可能是Wip1在肺癌細(xì)胞中致癌的一條途徑。既然這條通路在肺癌的形成中發(fā)揮了作用，那對(duì)于這條通路采取干預(yù)措施后是否會(huì)對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響呢?針對(duì)惡性腫瘤中p38 MAPK信號(hào)通路靶向治療的研究已經(jīng)開(kāi)始，Wip1對(duì)磷酸化的p38 MAPK的去磷酸化活性可以被ATO阻滯，也證實(shí)了在急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞中應(yīng)用ATO后出現(xiàn)了p38 MAPK的磷酸化誘導(dǎo)活化。更重要的是，這種ATO所引導(dǎo)的p38 MAPK/p53凋亡活化途徑可以通過(guò)siRNA技術(shù)抑制Wip1的表達(dá)而增強(qiáng)[21]。既然肺癌細(xì)胞中存在著Wip1－p38 MAPK－p53信號(hào)通路的失衡，是否ATO在肺癌中也能起到相同的作用呢?是否有更有效的藥物以Wip1－p38 MAPK－p53信號(hào)通路為靶的靶向治療呢?因此，Wip1這個(gè)新的原癌基因在肺癌的治療方面給我們帶來(lái)了新的思路。

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