田 野， 龐紅宇， 孫國亮， 李曉蕓， 位 靜， 黑子清△

(1中山市人民醫(yī)院麻醉科，廣東中山528403;2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510630)

肝移植術(shù)后早期急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)發(fā)生率為 8.3% － 87.0%[1－5]，病死率可高達(dá)12.3% －72.2%[6－8]，是肝移植術(shù)后早期死亡的主要原因之一[9]。肝移植術(shù)后發(fā)生ARF的患者術(shù)前均有不同程度的內(nèi)毒素血癥和高膽紅素血癥病史?，F(xiàn)有研究證實，內(nèi)毒素血癥與ARF的發(fā)生密切相關(guān)[10]。我們的研究證實膽紅素增高是引起肝移植ARF危險因素之一。然而在肝移植ARF的發(fā)生過程中，膽紅素(bilirubin，BR)和內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)的相互關(guān)系尚不清楚。

縫隙連接(gap junction，GJ)廣泛存在于實質(zhì)性臟器(如心臟、肝臟、腎臟等)組織中，GJ溝通相鄰細(xì)胞的胞漿，細(xì)胞漿中分子量＜1 kD的物質(zhì)(如離子、細(xì)胞信號分子和代謝物質(zhì)等)可通過GJ擴散、轉(zhuǎn)運到與其毗鄰的細(xì)胞漿。GJ具有傳導(dǎo)快、阻抗低的特點，參與細(xì)胞活動的協(xié)調(diào)及信息的傳遞，參與機體多種重要生理機能的調(diào)節(jié)。腎小管上皮細(xì)胞之間存在著廣泛的 GJ[11]。

在急性腎損傷過程中腎小管上皮細(xì)胞是主要受損的腎實質(zhì)細(xì)胞[12]。我們的前期研究已證實膽紅素的腎小管上皮細(xì)胞毒性與GJ有關(guān)[13]，在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞形成高密度集落，觀察BR和LPS聯(lián)合作用下腎小管上皮細(xì)胞的生長活性及細(xì)胞間GJ功能改變，有助于了解BR和LPS通過GJ途徑參與肝移植ARF的發(fā)生機制。

材料和方法

1 試劑

胎牛血清和 DMEM－F12培養(yǎng)基(Gibco)，0.25%胰酶(Gibco)，雙抗(Gibco)，LPS(Sigma)，oleamide(Invitrogen)，MTT(Amresco)，熒光試劑calcine－AM和DiI－CM(Invitrogen)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Invitrogen)，結(jié)晶紫(Sigma)，NaOH(Sigma)。

2 主要試劑的配制

BR試劑配制:避光稱取晶體 BR 100 mg，用1 mL 1 mol/L NaOH溶解，加入9 mL超純水，1 mol/L HCl調(diào)至pH 7.4。根據(jù)要求配制成對照組、BR組(17.1 μmol/L、85.5 μmol/L、171 μmol/L、342 μmol/L、513 μmol/L、684 μmol/L、855 μmol/L、1 026 μmol/L)。

LPS儲存液(100 mg/L):0.1 mg溶于1 mL超純水中，分裝100 μL于EP管 內(nèi)，－20℃凍存。根據(jù)要求配成 10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1 000 μg/L。

3 實驗分組

(1)正常對照組(control組):用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(2)膽紅素組(BR組):分為:17.1 μmol/L、85.5 μmol/L、171 μmol/L、342 μmol/L、513 μmol/L、684 μmol/L、855 μmol/L 和1 026 μmol/L共8個亞組;(3)內(nèi)毒素組(LPS組):分為:10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1 000 μg/L 5 個亞組;(4)膽紅素+內(nèi)毒素組(BR+LPS組):分為:100 μg/L LPS+17.1 μmol/L BR;100 μg/L LPS+513 μmol/L BR;100 μg/L LPS+684 μmol/L BR 3 個亞組。

4 方法

4.1 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E cells)的培養(yǎng) NRK52E細(xì)胞由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院余學(xué)清教授惠贈，NRK52E細(xì)胞具有正常人類腎小管上皮細(xì)胞的特性。NRK52E細(xì)胞用含10%胎牛血清的青－鏈霉素的DMEM－F12培養(yǎng)液中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

4.2 MTT法測生長活性 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液將NRK52E細(xì)胞配成單個細(xì)胞懸液，以每孔10 000個細(xì)胞的密度接種到96孔板，每孔體積200 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。NRK52E細(xì)胞在96孔板中貼壁(24 h)后加入不同濃度BR及LPS，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，每孔避光加入MTT溶液[5 g/L，用 PBS(pH 7.4)配制]20 μL，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，選擇490 nm波長，同時設(shè)置空白孔(含培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，記錄每孔

4.3 NRK52E細(xì)胞的集落形成率 采用Glazer報道的“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”[7]測定BR及LPS對NRK52E細(xì)胞集落形成的作用，用不同密度接種細(xì)胞的方法獲得生長融合的細(xì)胞(已形成GJ)和生長未融合的細(xì)胞(無形成GJ)。該實驗反映單個細(xì)胞的增殖潛力，能較靈敏地測定BR及LPS對細(xì)胞增殖能力的影響。

NRK52E細(xì)胞用0.25%胰酶消化后以8×108cells/L接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗1次。每孔細(xì)胞加入2 mL培養(yǎng)液，分別加入25 μmol/L oleamide不同劑量BR、LPS，置于培養(yǎng)箱中24 h后吸棄藥液，PBS洗2次。將每孔細(xì)胞用胰酶消化，做成單個細(xì)胞懸液，用細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化，細(xì)胞計數(shù)，分別稀釋成5×105cells/L的細(xì)胞懸浮液。按2 mL/well接種到6孔培養(yǎng)板，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3－5 d后計數(shù)細(xì)胞集落數(shù)(＞50個細(xì)胞/集落)。

4.4 NRK52E細(xì)胞間GJ的熒光傳遞 用細(xì)胞接種熒光示蹤法，將NRK52E細(xì)胞與熒光指示劑calcine－AM和DiI－CM共同孵育，使calcine－AM和DiI－CM進(jìn)入細(xì)胞。該細(xì)胞被稱為“供體細(xì)胞”(donor cell)。將“供體細(xì)胞”接種到已生長融合的細(xì)胞(“接受細(xì)胞”，receiver cells)上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，記錄GJ功能。小分子的calcine(發(fā)綠色熒光)可以通過GJ進(jìn)入相鄰的“接受細(xì)胞”;但大分子的DiI(發(fā)紅色熒光)不能自由通過GJ而留在“供體細(xì)胞”內(nèi)，使之易于識別。計數(shù)1個“供體細(xì)胞”周圍含有calcine的“接受細(xì)胞”作為GJ功能指標(biāo)。通過此方法可以直接測定信號傳遞情況。

將NRK52E細(xì)胞按1.0×108cells/L的密度接種到6孔板，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行如下實驗。在calcein－AM 50 μg/支和CM－ DiI 50 μg/支中分別加入 DMSO 10 μL 溶解，分別取5 μL calcein－ AM 和 10 μL CM － DiI加入 1 mL的無血清培養(yǎng)基混勻，calcein－AM的終濃度為25 μmol/L，CM －DiI的終濃度為 50 μmol/L ，作為負(fù)載液。取1孔細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，PBS洗1次。加入上述負(fù)載液1 mL。置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。吸去負(fù)載液，PBS沖洗 5 min×3次。用0.25%胰酶消化，加入無血清培養(yǎng)基中止消化。稀釋至8×105cells/L，制成“供體細(xì)胞”液 。在“供體細(xì)胞”液中加入實驗藥物，制備成不同濃度的藥液。在顯微鏡下挑選已融合(有GJ形成)的細(xì)胞作為接受細(xì)胞，移去培養(yǎng)液，PBS沖洗1次。分別加入已配制好的不同藥物濃度的“供體細(xì)胞”液，1 mL/well。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。形成穩(wěn)定的GJ后，用熒光顯微鏡觀察。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 LPS對NRK52E細(xì)胞生長的作用

結(jié)果顯示，LPS(10 －1 000 μg/L)作用于NRK52E細(xì)胞24 h能濃度依賴性地降低NRK52E細(xì)胞的生存率，見圖1，與對照組相比，當(dāng) LPS從10 μg/L增加至1 000 μg/L時，使NRK52E細(xì)胞生存率降低27%－60%。說明隨著LPS濃度增加，其細(xì)胞毒性逐漸增強。

Figure 1.The survival rate of NRK52E cells after treated with LPS for 24 h.±s.n=3.*P＜0.05 vs LPS 10 μg/L.圖1 LPS作用于NRK52E細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率的變化

2 BR對NRK52E細(xì)胞生長的作用

不同濃度的 BR(17.1－1 026 μmol/L)作用NRK52E細(xì)胞24 h后，MTT法測定的細(xì)胞生長結(jié)果見圖2。BR濃度從17.1 μmol/L增加至513 μmol/L時，可濃度依賴性地增加細(xì)胞生長。BR 513 μmol/L的細(xì)胞存活率為110%，與對照組相比增加46%。當(dāng)濃度繼續(xù)增加時，BR增加細(xì)胞生長的作用減弱;BR 1 026 μmol/L的細(xì)胞存活率為57%，與對照組相比降低24%，顯著差異(P＜0.05)。

Figure 2.The survival rate of NRK52E cells after treated with BR for 24 h.±s.n=3.*P＜0.05 vs control.圖2 BR作用于NRK52E細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率的變化

3 BR和LPS聯(lián)用對NRK52E細(xì)胞生長的作用

與單純 LPS組相比，17.1 μmol/L BR不影響100 μg/L LPS 對細(xì)胞生長的作用，513 μmol/L BR 增加100 μg/L LPS作用下的細(xì)胞生長(P＜0.05);684 μmol/L BR降低 100 μg/L LPS作用下的細(xì)胞生長(P＜0.05)。結(jié)果表明 BR在一定范圍內(nèi)(＜513 μmol/L)可以降低LPS的細(xì)胞毒性，BR超過這一范圍時卻增加了LPS的細(xì)胞毒性，見圖3。

Figure 3.The survival rate of NRK52E cells after treated with LPS and BR for 24h.*P ＜0.05 vs LPS 100 μg/L;#P＜0.05 vs control.圖3 LPS和BR聯(lián)合作用于NRK52E細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率變化

4 BR和LPS對NRK52E細(xì)胞集落形成的影響

生長融合的細(xì)胞經(jīng)100 μg/L LPS處理后細(xì)胞集落形成率均顯著低于生長未融合的細(xì)胞，513 μmol/L BR處理后生長融合細(xì)胞集落形成率高于生長未融合的細(xì)胞，684 μmol/L BR處理后細(xì)胞集落形成率低于生長未融合的細(xì)胞，見圖4。以上結(jié)果顯示生長融合的細(xì)胞和生長未融合的細(xì)胞集落形成率有顯著差異，說明生長融合的細(xì)胞形成GJ后，通過GJ信號傳遞影響了LPS和BR對細(xì)胞生長的作用。

5 BR和LPS聯(lián)合作用對NRK52E集落形成率的影響

在生長融合的細(xì)胞，513 μmol/L BR顯著增加100 μg/L LPS作用下的細(xì)胞集落形成率，684 μmol/L BR降低了100 μg/L LPS作用下的細(xì)胞集落形成率，P ＜0.05，見圖4。

6 BR和LPS對NRK52E細(xì)胞縫隙連接熒光傳遞的影響

與對照組相比，100 μg/L LPS能夠顯著降低calcine通過GJ在細(xì)胞之間的傳遞(P＜0.05);17.1 μmol/LBR對LPS作用下的GJ傳遞影響不大，BR在513 μmol/L通過GJ在細(xì)胞熒光傳遞有明顯增加(P＜0.05)，684 μmol/L BR明顯降低LPS作用下的熒光傳遞，見圖5、6。結(jié)果說明，BR在一定范圍內(nèi)(＜513 μmol/L)可以增加LPS作用下的細(xì)胞熒光傳遞，BR超過這一范圍時，降低了LPS作用下的NRK52E細(xì)胞熒光傳遞。

Figure 4.The colong－forming rate of NRK52E cells after treated with LPS and BR.±s.n=3.#P＜0.05 vs LPS 100 μg/L;*P ＜ 0.05 vs control.圖4 LPS加BR對NRK52E細(xì)胞集落形成率的影響

Figure 5.The number of dye spread through gap junction between NRK52E cells.#P ＜0.05 vs LPS 100 μg/L;*P＜0.05 vs control.圖5 染料通過NRK52E細(xì)胞間隙的數(shù)量

討 論

肝移植術(shù)后急性腎功能衰竭是影響肝移植手術(shù)預(yù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，許多研究已證實單純內(nèi)毒素血癥對腎小管上皮細(xì)胞的毒性作用，同時高膽紅素血癥對腎小管上皮細(xì)胞有保護(hù)和損傷的雙重作用，而肝移植手術(shù)患者BR及LPS均有不同程度的升高，觀察BR及LPS聯(lián)合作用下對腎小管上皮細(xì)胞的影響對于臨床如何調(diào)控BR及LPS從而減少肝移植術(shù)后腎功能損傷有重要意義。

Figure 6.The dye coupling through GJ between NRK52E cells after treated with LPS and BR for 24 h，as shown by parachute dye coupling assay(× 200).A:control group;B:100 μg/L LPS;C:513 μmol/L BR;D:513 μmol/L BR+100 μg/L LPS.圖6 LPS和BR作用于NRK52E細(xì)胞24 h對染料通過細(xì)胞間隙的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，BR在一定范圍內(nèi)(17.1－513 μmol/L)對NRK52E細(xì)胞生長呈促進(jìn)作用，隨著濃度增加作用增強;BR超過513 μmol/L抑制了NRK52E細(xì)胞的生長，呈現(xiàn)為細(xì)胞毒性。這一結(jié)果表明BR對細(xì)胞有保護(hù)或損傷的雙重作用，BR的濃度是決定因素。隨著 LPS濃度的增加(10－1 000 μg/L)，NRK52E細(xì)胞的生長逐漸降低，表明LPS對NRK52E細(xì)胞的毒性作用隨著濃度增加而增加。

根據(jù)BR和LPS對NRK52E細(xì)胞生長的觀察，我們選擇17.1 μmol/L 、513 μmol/L 和684 μmol/L BR分別與100 μg/L LPS聯(lián)合應(yīng)用，觀察聯(lián)合應(yīng)用后對細(xì)胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)513 μmol/L BR降低了LPS的細(xì)胞毒性，更高濃度BR(684 μmol/L)增強了LPS的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果進(jìn)一步證實，BR在一定濃度范圍能減輕LPS的細(xì)胞毒性，呈現(xiàn)腎保護(hù)效應(yīng)。動物實驗、體外和人體實驗均已證實BR能夠抑制脂質(zhì)氧化及氧自由基的形成，清除氧自由基，抑制免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)[14]。BR對臟器的作用與自身濃度有關(guān)，研究報道5 μmol/L的BR溶液可以完全抑制500 μmol/L 的 H2O2對腎造成的損傷[15];這些結(jié)果能幫助我們解釋低于513 μmol/L BR促進(jìn)細(xì)胞生長及減輕內(nèi)毒素腎小管上皮細(xì)胞毒性的原因。

GJ是細(xì)胞間主要的聯(lián)系方式，直接參與細(xì)胞生命活動，對調(diào)節(jié)機體組織的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起重要的作用。研究證明[11]，腎小管細(xì)胞有豐富的GJ;其中腎小管上皮細(xì)胞表達(dá) Cx43[16]。Yaoita 等[17]使用氨基核苷嘌呤霉素注射6 h造成腎損害，Cx43表達(dá)增強，提示GJ參與了腎損傷。GJ是否同樣參與了BR和LPS引起的NRK52E細(xì)胞的細(xì)胞毒性，我們將從這一途徑闡述這一問題。

生長融合細(xì)胞(細(xì)胞形成緊密連接，已形成GJ)和生長未融合的細(xì)胞(因細(xì)胞無接觸，細(xì)胞間無法形成GJ)，研究集落形成率的差異可以幫助分析細(xì)胞間相互影響。我們的結(jié)果表明，BR和LPS作用下，生長融合的細(xì)胞與生長未融合細(xì)胞集落形成率存在差異，提示GJ的形成與BR和LPS作用下的細(xì)胞活性有關(guān)，說明生長融合細(xì)胞間產(chǎn)生相互影響;513 μmol/L BR增加了LPS作用下高密度集落形成率，684 μmol/L BR降低了LPS作用下高密度集落形成率，提示BR有可能通過GJ信號傳遞影響LPS的細(xì)胞毒性作用。

細(xì)胞接種熒光示蹤法是檢測GJ功能的特異方法，可以直接觀察到生長融合細(xì)胞間的信號傳遞情況。我們的結(jié)果顯示，LPS降低了細(xì)胞熒光傳遞數(shù)目，513 μmol/L BR增加細(xì)胞熒光傳遞，能增加LPS作用下的熒光數(shù)目。684 μmol/L BR降低了細(xì)胞熒光傳遞數(shù)目，能協(xié)同降低LPS作用下的熒光傳遞。這些結(jié)果為 BR和 LPS通過 GJ信號傳遞影響NRK52E細(xì)胞活性提供了直接證據(jù)，兩者間的相互作用可能與細(xì)胞間GJ功能有關(guān)。

我們根據(jù)臨床肝移植術(shù)后病人BR升高的程度進(jìn)行分段，BR和LPS聯(lián)合作用時，513 μmol/L BR降低了LPS的腎小管上皮細(xì)胞毒性，684 μmol/L BR增加了LPS的腎小管上皮細(xì)胞毒性，肝移植手術(shù)病人應(yīng)降低LPS的水平，而BR水平在一定范圍內(nèi)對腎小管上皮細(xì)胞有保護(hù)作用，超過這一范圍呈現(xiàn)損傷作用，提示臨床肝移植手術(shù)后對于BR過高的患者，注意分清增高的程度，分級別對待，防止片面的一味降低BR水平。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，BR和LPS對NRK52E細(xì)胞的作用可能通過細(xì)胞間GJ發(fā)揮作用，隨著我們研究的深入，相信可以通過調(diào)控細(xì)胞間GJ從而減少BR和LPS對NRK52E細(xì)胞的損傷作用，為臨床減少肝移植術(shù)后腎功能損傷提供良好的理論基礎(chǔ)。

[1]Junge G，Schewior LV，Kohler S，et al.Acute renal failure after liver transplantation:incidence，etiology，therapy，and outcome[J].Transplant Proc，2006，38(3):723－724.

[2]Zhu FX，Liu CJ，Zhu JY，et al.Risk factors of renal failure in the early post－ liver transplantation period[J].Chin J Hepatol，2005，13(3):168 － 170.

[3]Lima EQ，Zanetta DM，Castro I，et al.Risk factors for development of acute renal failure after liver transplantation[J].Ren Fail，2003，25(4):553 －560.

[4]Bilbao I，Charco R，Balsells J，et al.Risk factors for acute renal failure requiring dialysis after liver transplantation[J].Clin Transplant，1998，12(2):123 －129.

[5]Chuang FR ，Lin CC ，Wang PH ，et al.Acute renal failure after cadaveric related liver transplantation[J].Transplant Proc，2004，36(8):2328 －2330.

[6]刑同海，彭志海，張 政，等.急性肝功能衰竭患者肝移植術(shù)后急性腎功能衰竭的病因分析及綜合治療[J].中華普通外科雜志，2008，23(7):496 －499.

[7]史穎弘，樊 嘉，周 儉，等.肝移植術(shù)后早期急性腎功能衰竭處理及危險因素分析[J].中華肝膽外科雜志，2007，13(2):98 －100.

[8]álvares－da－ Silva MR，Waechter FL，F(xiàn)rancisconi CF，et al.Risk factors for postoperative acute renal failure at a new orthotopic liver transplantation program [J].Transplant Proc，1999，31(7):3050 －3052.

[9]Nemes B，Kobori L，Galffy Z，et al.Clinical factors influencing the complications and survival of liver transplantation in Hungary[J].Orv Hetil，2005，146(30):1567 －1574.

[10]周立夫，吳建國.內(nèi)毒素介導(dǎo)動物急性腎功能衰竭機理的試驗研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36(3):283－287.

[11]Tao L，Harris AL.2－aminoethoxydiphenyl borate directly inhibits channels composed of connexin26 and/or connexin32[J].Mol Pharmacol，2007，71(2):570 －579.

[12]Harris AL.Connexin specificity of second messenger permeation:real numbers at last[J].Gen Physiol，2008，131(4):287－292.

[13]位 靜，甘小亮，羅晨芳，等.內(nèi)毒素對NRK52E細(xì)胞生長及細(xì)胞間縫隙連接功能的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2010，31(2):249 －252.

[14]Clark JE，F(xiàn)oresti R，Sarathchandra P，et al.Heme oxygenase－1－derived bilirubin ameliorates postischemic myocardial dysfunction[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，278(2):H643 － H651.

[15]Lanone S，Bloc S，F(xiàn)oresti R，et al.Bilirubin decreases NOS2 expression via inhibition of NAD(P)H oxidase:implications for protection against endotoxic shock in rats[J].FASEB J，2005，19(13):1890 －1892.

[16]Risek B，Pozzi A，Gilula NB.Modulation of gap junction expression during transient hyperplasia of rat epidermis.[J].J Cell Sci，1998，11(Pt 10):1395 －1404.

[17]Yaoita E，Yao J，Yoshida Y.Up － regulation of connexin43 in glomerular podocytes in response to injury[J].Am J Pathol，2002 ，161(5):1597 －1606.