張 娜, 韓雅玲, 田孝祥, 李 杰, 彭程飛, 閆承慧
(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院,全軍心血管病研究所,遼寧 沈陽(yáng)110016)
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)是從胚胎早期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的全能干細(xì)胞[1]。在小鼠ESCs分化過(guò)程中,去除ESCs的飼養(yǎng)層細(xì)胞和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)并將其懸浮培養(yǎng),ESCs可聚集成團(tuán),自發(fā)地分化形成具有3個(gè)胚層的胚胎小體(embryoid bodies,EBs)[2]。胚胎發(fā)育早期,EB內(nèi)層細(xì)胞自發(fā)性凋亡是三胚層結(jié)構(gòu)發(fā)生及胚胎發(fā)育的重要過(guò)程之一。如果EB細(xì)胞自發(fā)性凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)異常,則可能引起胚胎早期發(fā)育過(guò)程紊亂致使胚胎發(fā)育受到抑制或發(fā)生早期胚胎死亡。因此,探討ESCs分化過(guò)程中EBs抗凋亡和促凋亡機(jī)制,可能為闡明胚胎發(fā)育機(jī)制提供新的思路。
E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是從子宮頸內(nèi)膜癌HeLa細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆的一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)控因子[3]。已有研究表明,CREG促進(jìn)胚胎細(xì)胞或不成熟細(xì)胞的分化成熟,在成熟組織和細(xì)胞中高表達(dá),而在未成熟細(xì)胞如干細(xì)胞、人胚胎瘤細(xì)胞及未分化的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中低表達(dá)[4-7]。我們新近研究發(fā)現(xiàn),CREG在體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)能夠有效抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[8,9];在損傷血管中過(guò)表達(dá)CREG能夠維持VSMCs的分化表型,對(duì)抗損傷后VSMCs凋亡的發(fā)生;CREG對(duì)抗VSMCs凋亡的作用是通過(guò)其下游 p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的[10]。另外,CREG在胚胎發(fā)育早期E5.5 d表達(dá),提示其參與了胚胎發(fā)育的調(diào)控[6]。但CREG基因沉默對(duì)于ESCs早期發(fā)育中細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)以ESCs衍生的EBs為研究模型,探討CREG基因沉默在EBs凋亡中的作用。
昆明小鼠購(gòu)自沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物中心;小鼠胚胎干細(xì)胞株R1(SCRC-1011TM)和小鼠成纖維細(xì)胞株STO(CRL-1503TM)購(gòu)自ATCC;pEN_mH1c和pDS_hpEy載體由美國(guó)新澤西州立大學(xué)李少華教授饋贈(zèng);ES級(jí)胎牛血清(FCS)和DMEM干粉培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;胰蛋白酶、EDTA、非必需氨基酸、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉、Triton X-100和明膠購(gòu)自Sigma;谷氨酰胺購(gòu)自Gibco;重組人白血病抑制因子購(gòu)自Chemicon;絲裂霉素C購(gòu)自日本協(xié)和株式會(huì)社;Annexin VFITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD;抗cleaved caspase-3抗體和抗CREG抗體購(gòu)自RD;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色試劑盒購(gòu)自 Invitrogen;RTPCR檢測(cè)試劑盒及引物合成為T(mén)aKaRa。
2.1 CREG基因shRNA載體的構(gòu)建 小鼠CREG基因沉默表達(dá)載體pDS-shCREG由本室構(gòu)建。簡(jiǎn)述如下:應(yīng)用RNA干擾在線(xiàn)設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)4對(duì)可與小鼠CREG基因cDNA結(jié)合的短發(fā)夾RNA,具體序列如下:CREG-shRNA1:正義鏈5'-GATCCCCCAAGACAGAAGAGGACTATTTCAAGAGAATAGTCCTCTTCTGTCTTGTTTTTC -3',反 義 鏈 5'-TCGAGAAAAACAAGACAGAAGAGGATCTATTGAAATAGTCCTCTTCTGTCTTGGGG-3';CREG-shRNA2:正義鏈 5'-GATCCCCTCGCGGACATCATCTCAATTTCAAGAGAATTGAGATGATGTCCGCGATTTTTC-3',反義鏈 5'-TCGAGAAAAATCGCGGACATCATCTCAATTCTCTTGAAATTGAGATGATGTCCGCGAGGG-3';CREG-shRNA3:正義鏈5'-GATCCCCCTGGCCACTATCTCCACAATATTCAAGAGATATTGTGGAGATAGTGGCCAGTTTTTC -3',反義鏈 5'-TCGAGAAAAACTGGCCACTATCTCCACAATATCTCTTGAATATTGTGGAGATAGTGGCCAGGGG-3';CREG-shRNA4:正義鏈 5'-GATCCCCGAATGAATCCTTCAGTCGAGGTTCAAGAGACCTCGACTGAAGGATTCATTCTTTTTC -3',反義鏈5'-TCGAGAAAAAGAATGAATCCTTCAGTCGAGGTCTCTTGAACCTCGACTGAAGGATTCATTCGGG-3'。通過(guò)化學(xué)合成法合成并克隆至pEN_mH1c載體中,與目的載體pDS-h(huán)pEY進(jìn)行LR重組得到4種表達(dá)不同shCREG片段的表達(dá)載體 pDS - shCREGs[11]。
2.2 ESCs培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及陽(yáng)性克隆的篩選 ESCs用含15%FCS的DMEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。STO為飼養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)基中加入LIF以保持細(xì)胞全能性。用LipofectamineTM2000將pDS-shCREG干擾載體轉(zhuǎn)染R1細(xì)胞,37℃ 培養(yǎng)24 h,去掉轉(zhuǎn)染試劑后繼續(xù)培養(yǎng)72 h,加入G418進(jìn)行抗性篩選,G418篩選最適濃度為400 mg/L,挑取篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆R1-shCREG。以正常組R1和陰性對(duì)照質(zhì)粒GFP轉(zhuǎn)染的R1細(xì)胞(R1-GFP)為對(duì)照組進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。
2.3 EBs制備 ESCs培養(yǎng)至亞融合狀態(tài),用0.25%胰酶及0.53 mmol/L EDTA消化后,接種到明膠包被的培養(yǎng)皿中實(shí)施選擇性篩選,3 h后大部分STO細(xì)胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)液除無(wú)LIF外與ESCs培養(yǎng)液相同。連續(xù)培養(yǎng)3 d,中間不換液。第4 d,棄去7.5 mL原培養(yǎng)液,加入7.5 mL新鮮的EB細(xì)胞培養(yǎng)液。以后每天換液。
2.4 AKP染色 配制bufferⅢ緩沖液,其配方為:100 mmol/L Tris·HCl(pH 9.5),100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,將 BCIP/NBT 和 bufferⅢ按1∶100比例配制工作液。將3組ESCs接種到35 mm預(yù)先鋪有處理好的STO的組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng),2 d后棄掉培養(yǎng)液,PBS洗3遍。1%多聚甲醛4℃ 固定20 min,PBS洗3遍。加入1 mL配好的工作液,置于37℃孵育20 min后,取出于相差顯微鏡下觀(guān)察染色效果,當(dāng)出現(xiàn)紫色時(shí),以PBS終止顯色反應(yīng)。
2.5 小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn) 胰酶消化ESCs,注射入小鼠心肌,細(xì)胞數(shù)量為(1-4)×106,注射3周后將小鼠處死,取出心臟,4%多聚甲醛4℃ 固定20 min,PBS洗3遍。冰凍切片HE染色觀(guān)察成瘤情況。
2.6 RT-PCR Trizol一步法提取細(xì)胞總 RNA,各取 1 μg RNA 按 TaKaRa RNA PCR kit說(shuō)明書(shū),以GAPDH為內(nèi)參照,行cDNA合成及PCR擴(kuò)增,引物序列如下:CREG上游引物為5'-GGGGGCCCAGTGTCACCAGGAAC-3',下游引物為 5'-CGGGGGAGGCCATGACGGGAGTG-3';GAPDH上游引物為5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAAT -3',下游引物為5'-CCGTCACCGGAGTCCATCA-3';caspase-3上游引物為 5'-CAGTGGGCTCACTCTGAAGACC-3',下游引物為 5'- ACGCGTTACTGGCATTGAGG-3';GAPDH上游引物為5'-TATTGGGCGCCTGGTCACCA -3',下游引物為 5'-CCACCTTCTTGATGTCATCA-3'。CREG擴(kuò)增條件如下:25℃ 50 min,95℃ 10 min,95 ℃ 45 s,42 ℃ 30 s,48 ℃ 1 min,進(jìn)行45個(gè)循環(huán),最后48℃ 2 min,得到CREG產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為 670 bp,GAPDH產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為 750 bp;caspase-3的擴(kuò)增條件如下:50℃ 1 h,96℃ 5 min,96℃ 30 s,65 ℃ 30 s,69 ℃ 1 min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后69℃ 2 min,得到caspase-3產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為560 bp,GAPDH產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為650 bp。
2.7 Western blotting分析 按文獻(xiàn)[12]將全細(xì)胞提取物進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及顯色。分離膠濃度為 12%;I抗分別為抗cleaved caspase-3和CREG抗體。經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗孵育后,按ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)曝光處理。
2.8 Annexin V/PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化,收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以1×binding buffer重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI。室溫避光孵育15 min后,經(jīng)260目濾網(wǎng)過(guò)濾,行流式細(xì)胞儀檢測(cè)[13]。
倒置顯微鏡下觀(guān)察顯示,R1和R1-GFP均形成致密的細(xì)胞克隆,細(xì)胞克隆邊緣銳利清楚,以長(zhǎng)橢圓形或圓形為主,細(xì)胞體積小;而R1-shCREG細(xì)胞生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢,以長(zhǎng)橢圓形為主,R1-shCREG細(xì)胞邊緣與滋養(yǎng)層細(xì)胞分界相對(duì)模糊,細(xì)胞培養(yǎng)基中代謝廢物明顯增多,見(jiàn)圖 1A。R1-GFP、R1-shCREG和R1細(xì)胞的AKP染色發(fā)現(xiàn),3組ESCs染色均為紫色,無(wú)明顯分化現(xiàn)象,提示CREG基因沉默不影響ESCs的“干性”,見(jiàn)圖1B。
RT-PCR結(jié)果表明R1-shCREG/EB組的mRNA表達(dá)量明顯下降,與其它2組比較有顯著差異,見(jiàn)圖2A。Western blotting結(jié)果顯示,R1-shCREG/EB組 CREG的蛋白表達(dá)量較 R1/EB組和 R1-GFP/EB組分別下降了(78.0±1.3)%和(84.0±2.4)% ,P<0.05。而R1-GFP/EB組與正常R1/EB組相比無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)圖2B。
EBs分化實(shí)驗(yàn)顯示,CREG基因沉默組ESCs來(lái)源的EBs在體外培養(yǎng)過(guò)程中不能自發(fā)分化成三胚層結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖3A。同時(shí),小鼠心肌荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示,注射R1-shCREG組小鼠心肌內(nèi)不能形成畸胎瘤結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖3B。
用Annexin V-FITC/PI雙染色行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ESCs分化7 d的 R1/EB、R1-GFP/EB及 R1-shCREG/EB的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示,R1-shCREG/EB組細(xì)胞凋亡率明顯高于R1/EB組(P<0.05);而R1-GFP/EB組細(xì)胞的凋亡率與R1/EB組比較無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)圖4A。
RT-PCR和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與R1/EB組相比,ESCs分化7 d的R1-shCREG/EB細(xì)胞中caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05),見(jiàn)圖4B、C。上述結(jié)果證實(shí)CREG基因沉默誘導(dǎo)ESCs來(lái)源的EBs自發(fā)性凋亡增多。
Figure 1.Establishment of stably-transfected R1 cells(R1-shCREG and R1-GFP)and verification of stemness of transfected ESCs(×200).A:R1 was transfected with GFP and pDS-shRNA-CREG under phase-contrast microscope;B:alkaline phosphatase(AKP)staining.R1-GFP:R1 transfected with GFP;R1-shCREG:R1 transfected with pDS-shRNA- CREG.圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pDS-shRNA-CREG和GFP質(zhì)粒細(xì)胞克隆株的建立及堿性磷酸酶染色鑒定ESCs細(xì)胞全能性
胚胎的穩(wěn)定發(fā)育是指各個(gè)發(fā)育階段組織形態(tài)的穩(wěn)定,凋亡是確保這一穩(wěn)定的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。EB細(xì)胞自發(fā)性凋亡是三胚層結(jié)構(gòu)發(fā)生及胚胎發(fā)育的重要過(guò)程之一。若細(xì)胞自發(fā)性凋亡異常增加,導(dǎo)致組織細(xì)胞構(gòu)成失常,則無(wú)法維持胚胎的正常發(fā)育。我們前期研究證實(shí),CREG是一種分泌型糖蛋白,可以與胰島素樣生長(zhǎng)因子II競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞膜胰島素樣生長(zhǎng)因子受體II,以自分泌和旁分泌2種方式誘導(dǎo)并維持組織或細(xì)胞分化;在胚胎發(fā)育早期E9.5 d,血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)和血管平滑肌細(xì)胞分化始動(dòng)過(guò)程中即伴有CREG表達(dá),并持續(xù)整個(gè)胚胎血管發(fā)生過(guò)程。這一研究提示了CREG可能是血管發(fā)育過(guò)程中調(diào)控血管形成的重要因子。但本室前期研究也提示,降低成熟血管平滑肌細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中CREG的表達(dá),引起細(xì)胞大量的自發(fā)性凋亡發(fā)生。
因此,本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染,獲得穩(wěn)定的CREG基因沉默的胚胎干細(xì)胞株(R1-shCREG),從胚胎發(fā)育入手,利用我們已經(jīng)建立的離體胚胎干細(xì)胞體外分化模型,研究CREG基因沉默對(duì)ESCs來(lái)源的EBs自發(fā)性凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CREG基因沉默抑制了ESCs的分化,同時(shí)促進(jìn)EBs自發(fā)性凋亡。中胚層的分化、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及成熟是胚胎發(fā)生的基礎(chǔ),R1-shCREG/EB在發(fā)育過(guò)程中,細(xì)胞凋亡的控制介質(zhì)caspase-3明顯增多,在多種凋亡信號(hào)刺激下經(jīng)蛋白水解作用被激活成活化形式,可對(duì)多種蛋白底物進(jìn)行降解,影響三胚層的發(fā)育,不能形成典型的三胚層結(jié)構(gòu)使其結(jié)構(gòu)異?;蛘叻只怀墒?,EBs發(fā)生受到影響,胚胎發(fā)育被抑制。本研究證實(shí),下調(diào)CREG表達(dá)可以抑制ESCs分化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但進(jìn)一步的分子機(jī)制研究仍有待闡明。
Figure 2.The mRNA and protein expression of CREG in 3 kinds of EBs cultured for 7 d.A:the mRNA expression of CREG was assayed by RT-PCR;B:the protein expression of CREG was assayed by Western blotting.*P<0.05 vs R1;#P<0.05 vs R1-GFP.圖2 3組EBs培養(yǎng)7 d時(shí)檢測(cè)CREG mRNA和蛋白表達(dá)量
Figure 3.CREG gene silencing inhibited ESCs differentiation.A:differentiation of the 3 kinds of EBs on day 7 under phase-contrast microscope(×200);B:tumor formation assay inoculated in mouse myocardium.圖3 CREG基因沉默抑制ESCs分化
Figure 4.Apoptotic rate and the expression of caspase-3 mRNA and cleaved caspase-3 protein in 3 kinds of EBs on day 7.A:percentages of apoptotic cells were tested by Annexin V/PI dual-color flow cytometry;B:expression of caspase-3 mRNA in 3 kinds of ESCs were detected by RT-PCR;C:Western blotting was employed to test the protein expression of cleaved caspase-3.*P<0.05 vs R1 or R1-GFP.圖4 EBs培養(yǎng)7 d細(xì)胞凋亡率檢測(cè)及caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)
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