張 娜， 韓雅玲， 田孝祥， 李 杰， 彭程飛， 閆承慧

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，全軍心血管病研究所，遼寧 沈陽110016)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)是從胚胎早期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的全能干細(xì)胞[1]。在小鼠ESCs分化過程中，去除ESCs的飼養(yǎng)層細(xì)胞和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)并將其懸浮培養(yǎng)，ESCs可聚集成團(tuán)，自發(fā)地分化形成具有3個(gè)胚層的胚胎小體(embryoid bodies，EBs)[2]。胚胎發(fā)育早期，EB內(nèi)層細(xì)胞自發(fā)性凋亡是三胚層結(jié)構(gòu)發(fā)生及胚胎發(fā)育的重要過程之一。如果EB細(xì)胞自發(fā)性凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)異常，則可能引起胚胎早期發(fā)育過程紊亂致使胚胎發(fā)育受到抑制或發(fā)生早期胚胎死亡。因此，探討ESCs分化過程中EBs抗凋亡和促凋亡機(jī)制，可能為闡明胚胎發(fā)育機(jī)制提供新的思路。

E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A－stimulated genes，CREG)是從子宮頸內(nèi)膜癌HeLa細(xì)胞cDNA文庫中克隆的一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)控因子[3]。已有研究表明，CREG促進(jìn)胚胎細(xì)胞或不成熟細(xì)胞的分化成熟，在成熟組織和細(xì)胞中高表達(dá)，而在未成熟細(xì)胞如干細(xì)胞、人胚胎瘤細(xì)胞及未分化的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中低表達(dá)[4－7]。我們新近研究發(fā)現(xiàn)，CREG在體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)能夠有效抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[8，9];在損傷血管中過表達(dá)CREG能夠維持VSMCs的分化表型，對抗損傷后VSMCs凋亡的發(fā)生;CREG對抗VSMCs凋亡的作用是通過其下游 p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的[10]。另外，CREG在胚胎發(fā)育早期E5.5 d表達(dá)，提示其參與了胚胎發(fā)育的調(diào)控[6]。但CREG基因沉默對于ESCs早期發(fā)育中細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以ESCs衍生的EBs為研究模型，探討CREG基因沉默在EBs凋亡中的作用。

材料和方法

1 材料

昆明小鼠購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物中心;小鼠胚胎干細(xì)胞株R1(SCRC－1011TM)和小鼠成纖維細(xì)胞株STO(CRL－1503TM)購自ATCC;pEN_mH1c和pDS_hpEy載體由美國新澤西州立大學(xué)李少華教授饋贈;ES級胎牛血清(FCS)和DMEM干粉培養(yǎng)基購自Gibco;胰蛋白酶、EDTA、非必需氨基酸、β－巰基乙醇、丙酮酸鈉、Triton X－100和明膠購自Sigma;谷氨酰胺購自Gibco;重組人白血病抑制因子購自Chemicon;絲裂霉素C購自日本協(xié)和株式會社;Annexin VFITC凋亡檢測試劑盒購自BD;抗cleaved caspase－3抗體和抗CREG抗體購自RD;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色試劑盒購自 Invitrogen;RTPCR檢測試劑盒及引物合成為TaKaRa。

2 方法

2.1 CREG基因shRNA載體的構(gòu)建 小鼠CREG基因沉默表達(dá)載體pDS－shCREG由本室構(gòu)建。簡述如下:應(yīng)用RNA干擾在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)4對可與小鼠CREG基因cDNA結(jié)合的短發(fā)夾RNA，具體序列如下:CREG－shRNA1:正義鏈5'－GATCCCCCAAGACAGAAGAGGACTATTTCAAGAGAATAGTCCTCTTCTGTCTTGTTTTTC －3'，反 義 鏈 5'－TCGAGAAAAACAAGACAGAAGAGGATCTATTGAAATAGTCCTCTTCTGTCTTGGGG－3';CREG－shRNA2:正義鏈 5'－GATCCCCTCGCGGACATCATCTCAATTTCAAGAGAATTGAGATGATGTCCGCGATTTTTC－3'，反義鏈 5'－TCGAGAAAAATCGCGGACATCATCTCAATTCTCTTGAAATTGAGATGATGTCCGCGAGGG－3';CREG－shRNA3:正義鏈5'－GATCCCCCTGGCCACTATCTCCACAATATTCAAGAGATATTGTGGAGATAGTGGCCAGTTTTTC －3'，反義鏈 5'－TCGAGAAAAACTGGCCACTATCTCCACAATATCTCTTGAATATTGTGGAGATAGTGGCCAGGGG－3';CREG－shRNA4:正義鏈 5'－GATCCCCGAATGAATCCTTCAGTCGAGGTTCAAGAGACCTCGACTGAAGGATTCATTCTTTTTC －3'，反義鏈5'－TCGAGAAAAAGAATGAATCCTTCAGTCGAGGTCTCTTGAACCTCGACTGAAGGATTCATTCGGG－3'。通過化學(xué)合成法合成并克隆至pEN_mH1c載體中，與目的載體pDS－h(huán)pEY進(jìn)行LR重組得到4種表達(dá)不同shCREG片段的表達(dá)載體 pDS － shCREGs[11]。

2.2 ESCs培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及陽性克隆的篩選 ESCs用含15%FCS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。STO為飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入LIF以保持細(xì)胞全能性。用LipofectamineTM2000將pDS－shCREG干擾載體轉(zhuǎn)染R1細(xì)胞，37℃ 培養(yǎng)24 h，去掉轉(zhuǎn)染試劑后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入G418進(jìn)行抗性篩選，G418篩選最適濃度為400 mg/L，挑取篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆R1－shCREG。以正常組R1和陰性對照質(zhì)粒GFP轉(zhuǎn)染的R1細(xì)胞(R1－GFP)為對照組進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

2.3 EBs制備 ESCs培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25%胰酶及0.53 mmol/L EDTA消化后，接種到明膠包被的培養(yǎng)皿中實(shí)施選擇性篩選，3 h后大部分STO細(xì)胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液除無LIF外與ESCs培養(yǎng)液相同。連續(xù)培養(yǎng)3 d，中間不換液。第4 d，棄去7.5 mL原培養(yǎng)液，加入7.5 mL新鮮的EB細(xì)胞培養(yǎng)液。以后每天換液。

2.4 AKP染色 配制bufferⅢ緩沖液，其配方為:100 mmol/L Tris·HCl(pH 9.5)，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，將 BCIP/NBT 和 bufferⅢ按1∶100比例配制工作液。將3組ESCs接種到35 mm預(yù)先鋪有處理好的STO的組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，2 d后棄掉培養(yǎng)液，PBS洗3遍。1%多聚甲醛4℃ 固定20 min，PBS洗3遍。加入1 mL配好的工作液，置于37℃孵育20 min后，取出于相差顯微鏡下觀察染色效果，當(dāng)出現(xiàn)紫色時(shí)，以PBS終止顯色反應(yīng)。

2.5 小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn) 胰酶消化ESCs，注射入小鼠心肌，細(xì)胞數(shù)量為(1－4)×106，注射3周后將小鼠處死，取出心臟，4%多聚甲醛4℃ 固定20 min，PBS洗3遍。冰凍切片HE染色觀察成瘤情況。

2.6 RT－PCR Trizol一步法提取細(xì)胞總 RNA，各取 1 μg RNA 按 TaKaRa RNA PCR kit說明書，以GAPDH為內(nèi)參照，行cDNA合成及PCR擴(kuò)增，引物序列如下:CREG上游引物為5'－GGGGGCCCAGTGTCACCAGGAAC－3'，下游引物為 5'－CGGGGGAGGCCATGACGGGAGTG－3';GAPDH上游引物為5'－ATCTGGCACCACACCTTCTACAAT －3'，下游引物為5'－CCGTCACCGGAGTCCATCA－3';caspase－3上游引物為 5'－CAGTGGGCTCACTCTGAAGACC－3'，下游引物為 5'－ ACGCGTTACTGGCATTGAGG－3';GAPDH上游引物為5'－TATTGGGCGCCTGGTCACCA －3'，下游引物為 5'－CCACCTTCTTGATGTCATCA－3'。CREG擴(kuò)增條件如下:25℃ 50 min，95℃ 10 min，95 ℃ 45 s，42 ℃ 30 s，48 ℃ 1 min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后48℃ 2 min，得到CREG產(chǎn)物片段長度為 670 bp，GAPDH產(chǎn)物片段長度為 750 bp;caspase－3的擴(kuò)增條件如下:50℃ 1 h，96℃ 5 min，96℃ 30 s，65 ℃ 30 s，69 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后69℃ 2 min，得到caspase－3產(chǎn)物片段長度為560 bp，GAPDH產(chǎn)物片段長度為650 bp。

2.7 Western blotting分析 按文獻(xiàn)[12]將全細(xì)胞提取物進(jìn)行SDS－PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及顯色。分離膠濃度為 12%;I抗分別為抗cleaved caspase－3和CREG抗體。經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗孵育后，按ECL試劑盒說明書曝光處理。

2.8 Annexin V/PI雙染色檢測細(xì)胞凋亡 胰酶消化，收集細(xì)胞。按照Annexin V－FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作。以1×binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V－FITC及5 μL PI。室溫避光孵育15 min后，經(jīng)260目濾網(wǎng)過濾，行流式細(xì)胞儀檢測[13]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CREG基因沉默R1細(xì)胞株(R1－shCREG)

倒置顯微鏡下觀察顯示，R1和R1－GFP均形成致密的細(xì)胞克隆，細(xì)胞克隆邊緣銳利清楚，以長橢圓形或圓形為主，細(xì)胞體積小;而R1－shCREG細(xì)胞生長速度相對較慢，以長橢圓形為主，R1－shCREG細(xì)胞邊緣與滋養(yǎng)層細(xì)胞分界相對模糊，細(xì)胞培養(yǎng)基中代謝廢物明顯增多，見圖 1A。R1－GFP、R1－shCREG和R1細(xì)胞的AKP染色發(fā)現(xiàn)，3組ESCs染色均為紫色，無明顯分化現(xiàn)象，提示CREG基因沉默不影響ESCs的“干性”，見圖1B。

2 R1－shCREG組來源的EBs中CREG表達(dá)受到明顯抑制

RT－PCR結(jié)果表明R1－shCREG/EB組的mRNA表達(dá)量明顯下降，與其它2組比較有顯著差異，見圖2A。Western blotting結(jié)果顯示，R1－shCREG/EB組 CREG的蛋白表達(dá)量較 R1/EB組和 R1－GFP/EB組分別下降了(78.0±1.3)%和(84.0±2.4)% ，P＜0.05。而R1－GFP/EB組與正常R1/EB組相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖2B。

3 CREG基因沉默抑制ESCs分化

EBs分化實(shí)驗(yàn)顯示，CREG基因沉默組ESCs來源的EBs在體外培養(yǎng)過程中不能自發(fā)分化成三胚層結(jié)構(gòu)，見圖3A。同時(shí)，小鼠心肌荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示，注射R1－shCREG組小鼠心肌內(nèi)不能形成畸胎瘤結(jié)構(gòu)，見圖3B。

4 CREG基因沉默誘導(dǎo)ESCs來源的EBs凋亡

用Annexin V－FITC/PI雙染色行流式細(xì)胞術(shù)檢測ESCs分化7 d的 R1/EB、R1－GFP/EB及 R1－shCREG/EB的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，R1－shCREG/EB組細(xì)胞凋亡率明顯高于R1/EB組(P＜0.05);而R1－GFP/EB組細(xì)胞的凋亡率與R1/EB組比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖4A。

RT－PCR和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，與R1/EB組相比，ESCs分化7 d的R1－shCREG/EB細(xì)胞中caspase－3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，見圖4B、C。上述結(jié)果證實(shí)CREG基因沉默誘導(dǎo)ESCs來源的EBs自發(fā)性凋亡增多。

Figure 1.Establishment of stably－transfected R1 cells(R1－shCREG and R1－GFP)and verification of stemness of transfected ESCs(×200).A:R1 was transfected with GFP and pDS－shRNA－CREG under phase－contrast microscope;B:alkaline phosphatase(AKP)staining.R1－GFP:R1 transfected with GFP;R1－shCREG:R1 transfected with pDS－shRNA－ CREG.圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pDS－shRNA－CREG和GFP質(zhì)粒細(xì)胞克隆株的建立及堿性磷酸酶染色鑒定ESCs細(xì)胞全能性

討 論

胚胎的穩(wěn)定發(fā)育是指各個(gè)發(fā)育階段組織形態(tài)的穩(wěn)定，凋亡是確保這一穩(wěn)定的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。EB細(xì)胞自發(fā)性凋亡是三胚層結(jié)構(gòu)發(fā)生及胚胎發(fā)育的重要過程之一。若細(xì)胞自發(fā)性凋亡異常增加，導(dǎo)致組織細(xì)胞構(gòu)成失常，則無法維持胚胎的正常發(fā)育。我們前期研究證實(shí)，CREG是一種分泌型糖蛋白，可以與胰島素樣生長因子II競爭性結(jié)合細(xì)胞膜胰島素樣生長因子受體II，以自分泌和旁分泌2種方式誘導(dǎo)并維持組織或細(xì)胞分化;在胚胎發(fā)育早期E9.5 d，血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)和血管平滑肌細(xì)胞分化始動過程中即伴有CREG表達(dá)，并持續(xù)整個(gè)胚胎血管發(fā)生過程。這一研究提示了CREG可能是血管發(fā)育過程中調(diào)控血管形成的重要因子。但本室前期研究也提示，降低成熟血管平滑肌細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中CREG的表達(dá)，引起細(xì)胞大量的自發(fā)性凋亡發(fā)生。

因此，本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染，獲得穩(wěn)定的CREG基因沉默的胚胎干細(xì)胞株(R1－shCREG)，從胚胎發(fā)育入手，利用我們已經(jīng)建立的離體胚胎干細(xì)胞體外分化模型，研究CREG基因沉默對ESCs來源的EBs自發(fā)性凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CREG基因沉默抑制了ESCs的分化，同時(shí)促進(jìn)EBs自發(fā)性凋亡。中胚層的分化、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及成熟是胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)，R1－shCREG/EB在發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡的控制介質(zhì)caspase－3明顯增多，在多種凋亡信號刺激下經(jīng)蛋白水解作用被激活成活化形式，可對多種蛋白底物進(jìn)行降解，影響三胚層的發(fā)育，不能形成典型的三胚層結(jié)構(gòu)使其結(jié)構(gòu)異?；蛘叻只怀墒?，EBs發(fā)生受到影響，胚胎發(fā)育被抑制。本研究證實(shí)，下調(diào)CREG表達(dá)可以抑制ESCs分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但進(jìn)一步的分子機(jī)制研究仍有待闡明。

Figure 2.The mRNA and protein expression of CREG in 3 kinds of EBs cultured for 7 d.A:the mRNA expression of CREG was assayed by RT－PCR;B:the protein expression of CREG was assayed by Western blotting.*P＜0.05 vs R1;#P＜0.05 vs R1－GFP.圖2 3組EBs培養(yǎng)7 d時(shí)檢測CREG mRNA和蛋白表達(dá)量

Figure 3.CREG gene silencing inhibited ESCs differentiation.A:differentiation of the 3 kinds of EBs on day 7 under phase－contrast microscope(×200);B:tumor formation assay inoculated in mouse myocardium.圖3 CREG基因沉默抑制ESCs分化

Figure 4.Apoptotic rate and the expression of caspase－3 mRNA and cleaved caspase－3 protein in 3 kinds of EBs on day 7.A:percentages of apoptotic cells were tested by Annexin V/PI dual－color flow cytometry;B:expression of caspase－3 mRNA in 3 kinds of ESCs were detected by RT－PCR;C:Western blotting was employed to test the protein expression of cleaved caspase－3.*P＜0.05 vs R1 or R1－GFP.圖4 EBs培養(yǎng)7 d細(xì)胞凋亡率檢測及caspase－3 mRNA和蛋白表達(dá)

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