崔學(xué)江， 朱定軍， 韓金利， 梁 武， 蘇嘉銳， 謝文練

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510120)

B細(xì)胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI－1)基因過度表達(dá)可與多種腫瘤細(xì)胞的形成及增殖形成有關(guān)[1]。研究表明在膀胱癌細(xì)胞中BMI－1亦有較高表達(dá)，但其促癌作用機(jī)制尚未完全明確。本課題組前期研究表明BMI-1基因在膀胱癌組織中的mRNA及蛋白表達(dá)，明顯高于癌旁組織，并且其表達(dá)量隨著腫瘤侵潤深度的增加和分化程度的降低而明顯升高，且與p16INK4a和p14ARF基因在膀胱癌組織及癌旁組織中的mRNA及蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[2]。本研究旨在進(jìn)一步對膀胱癌EJ細(xì)胞株及膀胱正常移行上皮細(xì)胞中BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA及蛋白表達(dá)水平比較;同時(shí)構(gòu)建siRNA干擾BMI－1基因，檢測其mRNA及蛋白表達(dá)的影響及對下游p16和p14基因mRNA及蛋白水平的調(diào)控作用及對細(xì)胞增殖的影響。

材料和方法

1 材料

膀胱癌EJ細(xì)胞株及膀胱正常移行上皮細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室惠贈。DMEM培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基、胎牛血清和無血清培養(yǎng)基Opti-MEM為Gibco產(chǎn)品;RNAiso和real-time RT-PCR試劑盒購于TaKaRa(大連寶生物工程有限公司);siRNA Oligo由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)及合成;Lipofectine 2000購自Invitrogen;鼠抗人BMI-1單克隆抗體(05-637)購自Upstate;p16INK4a(sc-468)、p14ARF(sc-8340)購自 Stanta Cruz Biotechnology;β-actin購自Cell Signaling Technology;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔IgG購自Multiscience購自聯(lián)科生物公司;化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜購自Millipore。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組

BMI－1基因(NM:005180)的siRNA 長度為21 nt，序列見表 1。EJ細(xì)胞于含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，膀胱正常移行上皮細(xì)胞用f-12k培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，0.125%胰酶消化傳代。5×108/L細(xì)胞種于6孔板，細(xì)胞80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000用于siRNA轉(zhuǎn)染。

使用帶綠色熒光的非干擾BMI－1基因的小分子RNA(FAM-nag-siRNA)，6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔的細(xì)胞密度為6.0×105個(gè)，培養(yǎng)基2 mL;使用Lipo 5 μL/well，F(xiàn)AM-nag-siRNA共分以下4個(gè)濃度:50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L 和 150 nmol/L，得出轉(zhuǎn)染率最佳的siRNA濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為5組:A:空白對照組;B:陰性干擾對照組;C:RNA干擾BMI－1基因12 h組;D:RNA干擾BMI－1基因24 h組;E:RNA干擾BMI－1基因48 h組。取轉(zhuǎn)染率最佳的轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染12 h、24 h、48 h后提取RNA和轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后提取蛋白質(zhì)。

3 實(shí)時(shí)定量RT－PCR

Trizol兩步法提取膀胱正常移行上皮細(xì)胞和EJ細(xì)胞的總RNA，以mRNA為模板，oligo dT為引物，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。Real-time PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個(gè)循環(huán);熔解曲線分析95℃ 1 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s。LightCycler(Roche Diagnostics)實(shí)時(shí)定量PCR檢測干擾前后及對照組EJ細(xì)胞和膀胱正常移行上皮細(xì)胞中BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA的表達(dá)差異。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量RT－PCR及RNAi引物序列Table 1.Sequences of primers for real-time RT-PCR and RNAi

4 Western blotting檢測

BMI-1、p16INK4a和p14ARF在EJ細(xì)胞和膀胱正常移行上皮細(xì)胞的表達(dá):按常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量(Bradford法)。6孔板細(xì)胞覆蓋80%后以RIPA緩沖液0.8 mL，冰上裂解30 min，12 000×g離心30 min，取上清液并進(jìn)行蛋白定量。組織及細(xì)胞裂解液每道上樣量25 μg，10%-15%十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳，低電壓轉(zhuǎn)膜過夜。PVDF膜于10%脫脂奶粉封閉4 h，加入抗BMI-1抗體(1∶750)、抗 p16INK4a抗體(1∶250)、抗 p14ARF抗體(1∶250)、抗β-actin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，然后加入羊抗鼠及羊抗兔IgG 1∶7 500 1 h，化學(xué)發(fā)光后X光片曝光。

5 細(xì)胞免疫熒光

采用雙染法。I抗抗 BMI-1抗體(1∶50)，抗p16INK4a(1∶50)、抗 p14ARF(1∶50);熒光Ⅱ抗，CY3-羊抗小鼠 IgG(1∶75)，F(xiàn)ITC-羊抗兔 IgG(1∶50)。核染料采用DAPI染核15 min。

6 生長曲線測定

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活情況并繪制生長曲線。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

BMI-1蛋白在膀胱癌EJ 細(xì)胞陽性反應(yīng)為紅色熒光，主要表達(dá)于細(xì)胞核，部分胞漿亦有熒光染色;p16INK4a和p14ARF蛋白均表達(dá)于膀胱癌多種細(xì)胞株細(xì)胞，陽性呈綠色熒光，兩者在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均可見綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)光，見圖1。

Figure 1.Cellular immunofluorescence of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin T24 cells(A)，EJ cells(B)，5637 cells(C)and Tccsup cells(D).BMI-1 displays red.p16INK4a and p14ARFdisplay green(a2 is p16INK4a，b2 is p14ARF).Nuclear displays blue(×400).圖1 BMI－1、p16INK4a和p14ARF蛋白在 EJ細(xì)胞、T24細(xì)胞、5637細(xì)胞和Tccsup細(xì)胞中的表達(dá)

2 BMI－1、p16INK4a和 p14ARF在人膀胱移行上皮細(xì)胞及EJ細(xì)胞中的mRNA及蛋白表達(dá)水平

實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測mRNA水平，BMI-1 mRNA在EJ細(xì)胞中表達(dá)高于正常膀胱移行上皮細(xì)胞，而p16INK4a和p14ARFmRNA在EJ細(xì)胞中低表達(dá)，P＜0.05，差異顯著;Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平，與mRNA表達(dá)基本一致，BMI-1蛋白在EJ細(xì)胞中表達(dá)較正常膀胱移行上皮細(xì)胞中高，p16INK4a和p14ARF蛋白表達(dá)在EJ細(xì)胞中表達(dá)低，見圖2。

Figure 2.The relative expression levels of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin hBTC and EJ cells.±s.n=4.*P＜0.05 vs hBTC.hBTC:human bladder transitional epithelium cells.圖2 BMI－1、p16INK4a和p14ARF在EJ細(xì)胞及人膀胱移行上皮細(xì)胞中mRNA和蛋白的相對表達(dá)量

3 不同siRNA濃度的轉(zhuǎn)染率

FAM-nag-siRNA分為以下4個(gè)濃度:50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L 和 150 nmol/L，測得轉(zhuǎn)染率分別為:(67.25±2.97)%、(81.66±0.64)%、(92.55±0.41)%和(91.56±1.39)%，即siRNA濃度為100 nmol/L時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，各組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Transfection efficiencies of four concentrations of FAM-nag-siRNA(×100).A:50 nmol/L(67.25% ±2.97%);B:75 nmol/L(81.66%±0.64%);C:100 nmol/L(92.55%±0.41%);D:150 nmol/L(91.56%±1.39%);E:transfected EJ cells in white light;F:transfected EJ cells in green light.圖3 4種濃度FAM－nag－siRNA的轉(zhuǎn)染率

4 轉(zhuǎn)染后EJ細(xì)胞目的基因表達(dá)情況

實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測 BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA(100 nmol/L)干擾BMI-1后其mRNA相對表達(dá)量在24 h和48 h與空白組相比顯著下降(P＜0.05)，而p16INK4a和p14ARFmRNA相對表達(dá)量在干擾后12 h、24 h和48 h均比空白組顯著上升(P＜0.05)，見圖4。

Western blotting檢測蛋白相對表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾BMI－1后，BMI-1蛋白表達(dá)量下降，并且在72 h時(shí)下降最明顯;p16INK4a和p14ARF蛋白量上升，分別于48 h和72 h上升最明顯，見圖5。

5 CCK－8分析轉(zhuǎn)染后EJ細(xì)胞活力及生長的變化

干擾后的EJ細(xì)胞與空白對照組、陰性對照組相比，12 h、24 h EJ細(xì)胞存活數(shù)無明顯變化。48 h開始siRNA干擾組(0.450±0.198)、空白對照組(0.810±0.089)和陰性對照組(0.790±0.099)之間的差異顯著(P＜0.05)。干擾BMI－1后EJ細(xì)胞在72 h處于生長平臺期，生長速度變緩，見圖6。

6 EJ細(xì)胞的凋亡情況

各組EJ細(xì)胞的凋亡率為:空白對照組(5.85±0.31)%，陰性對照組(6.52±0.46)%，干擾48 h后(12.74±0.76)%，干擾72 h后(16.34±0.77)%?？瞻讓φ战M與陰性對照組比差異不顯著(P＞0.05);空白對照組分別與干擾48 h、72 h比，差異均顯著(P＜0.01)，干擾48 h與72 h比差異顯著(P＜0.01)，見圖7。

Figure 4.The mRNA expression of BMI-1，p16INK4aand p14ARF in EJ cells with different treatments.A:BMI-1;B:p16INK4aand p14ARF.NC:normal control;NEG:negative control;12 h:RNAi for 12 h;24 h:RNAi for 24 h;48 h:RNAi for 48 h.±s.n=4.圖4 siRNA干擾BMI－1后不同時(shí)點(diǎn) BMI－1、p16INK4a和p14ARFmRNA的表達(dá)

Figure 5.The protein levels of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin EJ cells with different treatments.±s.n=5.*P＜0.05 vs NC.圖5 siRNA干擾BMI－1后不同時(shí)點(diǎn)BMI－1、p16INK4a和p14ARF蛋白的表達(dá)

Figure 6.Growth curves of EJ cells with different treatments.圖6 空白對照組、陰性對照組和RNA干擾BMI－1組的EJ細(xì)胞生長曲線

討 論

BMI－1基因被認(rèn)為是一種癌基因，其可與cmyc癌基因協(xié)同作用引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。[1，3]。p16INK4a和 p14ARF是重要的抑癌基因，其功能的失活在多種腫瘤的發(fā)生中起重要作用[4，5]。但是在腫瘤細(xì)胞株及正常的膀胱移行上皮細(xì)胞中的比較仍少見報(bào)道，并且BMI-1與p16INK4a、p14ARF的調(diào)控機(jī)制仍未明確。本文通過對其表達(dá)及siRNA干擾BMI－1基因后上述基因的表達(dá)及蛋白表達(dá)的變化進(jìn)一步明確其調(diào)控機(jī)制。

Figure 7.The apoptosis of EJ cells detected by flow cytometry.A:normal control(5.85%±0.31%);B:negative control(6.52%±0.46%);C:RNAi for 48 h(12.74%±0.76%);D:RNAi for 72 h(16.34%±0.77%).± s.n=20.*P ＜0.05 vs A.圖7 siRNA干擾48 h和72 h后EJ細(xì)胞凋亡情況

本研究結(jié)果表明:BMI-1 mRNA及蛋白水平在膀胱癌EJ細(xì)胞株中的表達(dá)比膀胱正常移行上皮細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高。對于BMI-1的表達(dá)，有研究表明在多種腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)，其對造血干細(xì)胞、白血病細(xì)胞的自我更新起重大作用，在乳腺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤等腫瘤，以及膀胱癌組織、膀胱癌T24細(xì)胞株、5637細(xì)胞株中均發(fā)現(xiàn)較高表達(dá)[6-8]。BMI－1基因作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，對腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)起抑制作用，影響細(xì)胞的增殖及凋亡[8]。膀胱癌EJ細(xì)胞株屬于惡性度較高的細(xì)胞株，目前較少研究BMI-1在其中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制。本研究結(jié)果提示在EJ細(xì)胞中，BMI-1的高表達(dá)，說明膀胱癌EJ細(xì)胞中BMI-1為其促癌的一個(gè)可能的重要靶點(diǎn)。

對于BMI-1的調(diào)控機(jī)制，Park等[8]研究表明BMI-1可抑制p16INK4a和p14ARF的表達(dá)，導(dǎo)致癌基因過度激活和抑癌基因失活而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡，Liu等[9]研究表明BMI-1與多種蛋白如c-Myc等對cyclin D2進(jìn)行調(diào)節(jié)。但亦有研究表明BMI-1調(diào)控下游基因存在PI3K/Akt通路[9]及調(diào)節(jié)端粒酶的活性影響細(xì)胞增殖[10]，陳鳳花等[11]研究真核表達(dá)載體pEGFP-BMI-1轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系HeLa，顯著下調(diào) p16INK4a、HOXA9和 HOXC13的表達(dá)，而hTERT和HOXB4無明顯影響。在膀胱癌EJ細(xì)胞中，仍未有明確的研究表明BMI-1的調(diào)控機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示p16INK4a和p14ARF在EJ細(xì)胞中的表達(dá)較膀胱正常移行上皮細(xì)胞低。以往較多研究使用反義寡核苷酸及shRNA、mircoRNA等抑制BMI－1基因，可以起到抑制作用[12]。本研究使用siRNA干擾BMI－1基因后，BMI-1 mRNA及蛋白水平都有下降，提示使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA可以有效沉默BMI－1基因。沉默后p16INK4a和p14ARF升高，說明兩者有相關(guān)性，在調(diào)節(jié)通路上，p16與p14具有某些共同的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。沉默BMI－1后EJ細(xì)胞的凋亡增多，提示在EJ細(xì)胞中，BMI-1調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的機(jī)制主要為調(diào)節(jié)其下游p16INK4a和p14ARF，并且通過抑制p16INK4a和p14ARF的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。目前研究表明，p16INK4a與調(diào)節(jié) cyclin D/CDK4/6有關(guān)，而p14ARF與抑制MDM2作用減弱有關(guān)，兩者都有共同通路就是使E2F轉(zhuǎn)錄蛋白增多，細(xì)胞增殖增強(qiáng)[13]。

Silva等[14]在乳腺癌中的研究表明 BMI-1對INK4a/ARF的轉(zhuǎn)錄抑制是通過其多梳基因家族(PcG)的Mel18和Hpc2蛋白形成多梳組多蛋白抑制復(fù)合物1(PRC1)，協(xié)同作用抑制。Dhawan等[15]在對胰島β細(xì)胞的研究中表明，BMI-1與PcG家族中的Ezh2蛋白構(gòu)成PRC1的重要組成部分;Ezh2蛋白導(dǎo)致H3K27三甲基化，增加BMI-1與H2組蛋白、INK4a/ARF位點(diǎn)的結(jié)合力，導(dǎo)致H2組蛋白泛素化，抑制INK4a/ARF轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)在膀胱癌細(xì)胞EJ細(xì)胞中，BMI－1是一個(gè)重要的癌基因位點(diǎn)，其與cmyc協(xié)同作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，可以作為一個(gè)檢測及治療的新靶點(diǎn)。同時(shí)，使用siRNA干擾技術(shù)可以有效沉默BMI－1基因;在膀胱癌EJ細(xì)胞中存在p16INK4a/p14ARF調(diào)控通路，沉默BMI－1可以通過該通路影響細(xì)胞生長周期及凋亡。

[1]van Lohuizen M，Verbeek S，Scheijen B，et al.Identification of cooperating oncogenes in Eμ-myc transgenic mice by provirus tagging[J].Cell，1991，65(5):737-752.

[2]劉宏偉，謝文練，韓金利，等.Bmi-1在膀胱移行細(xì)胞癌組織的表達(dá)及與p16INK4a和p14ARF的關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，27(10):1542-1543.

[3]Reinisch C，Kandutsch S，Uthman A，et al.BMI-1:a protein expressed in stem cells，specialized cells and tumors of the gastrointestinal tract[J].Histol Histopathol，2006，21(11):1143-1149.

[4]張 軍，張 旭，許 凱，等.膀胱移行細(xì)胞癌患者血清p14基因異常甲基化檢測的意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2007，24(3):333-335.

[5]楊志偉，鄭新民，胡禮泉，等.原發(fā)性膀胱移行細(xì)胞癌p16基因缺失突變的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2001，18(1):8-9.

[6]林妙霞，文卓夫，馮智英，等.大腸癌中Bmi-1的表達(dá)及其臨床病理意義[J].中國病理生理雜志，2009，25(3):497-501.

[7]呂 進(jìn)，曹秀峰，紀(jì) 律，等.β-catenin、Wnt1、Smad4、Hoxa9、Bmi-1與食管鱗癌預(yù)后的關(guān)系[J].世界華人消化雜志，2010，18(27):2874-2883.

[8]Park IK，Morrison SJ，Clarke MF.Bmi1，stem cells，and senescence regulation[J].J Clin Invest，2004，113(2):175-179.

[9]Liu Y，Yang Y，Xu H，et al.Implication of USP22 in the regulation of BMI-1，c-Myc，p16INK4a，p14ARF，and cyclin D2 expression in primary colorectal carcinomas[J].Diagn Mol Pathol，2010，19(4):194-200.

[10]Qin ZK，Yang JA，Ye YL，et al.Expression of Bmi-1 is a prognostic marker in bladder cancer[J].BMC Cancer，2009，9:61.

[11]陳鳳花，李一榮，王 琳，等.過表達(dá)BMI-1對HeLa細(xì)胞中HOX基因表達(dá)和細(xì)胞周期的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25(12):2366-2370.

[12]廖百花，馮亦軍，曾祿賢，等.固相轉(zhuǎn)染HPV16-siRNA對荷宮頸癌細(xì)胞SiHa小鼠瘤體體積及P53、P16表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志，2011，27(3):509-513.

[13]Breuer RH，Snijders PJ，Sutedja GT，et al.Expression of the p16INK4agene product，methylation of the p16INK4apromoter region and expression of the polycomb-group gene BMI-1 in squamous cell lung carcinoma and premalignant endo-bronchial lesions[J].Lung Cancer，2005，48(3):299-306.

[14]Silva J，García JM，Pe?a C，et al.Implication of polycomb members Bmi-1，Mel-18，and Hpc-2 in the regulation of p16INK4a，p14ARF，h-TERT，and c-Myc expression in primary breast carcinomas[J].Clin Cancer Res，2006，12(23):6929-6936.

[15]Dhawan S，Tschen SI，Bhushan A.Bmi-1 regulates the Ink4a/Arf locus to control pancreatic β-cell proliferation[J].Genes Dev，2009，23(8):906-911.