蔡清清， 丁 穎， 林天歆， 黃慧強(qiáng)△

(1中山大學(xué)腫瘤防治中心內(nèi)科，廣東廣州510060;2廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州510080;3中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510120)

廣東省是全球鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)最高發(fā)的地區(qū)，目前廣東省每年的鼻咽癌新發(fā)病例約5 000例，而我院每年的收治鼻咽癌新發(fā)病例約3 000例。頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是目前判斷NPC預(yù)后的重要因素。然而，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)對預(yù)后的預(yù)測準(zhǔn)確率并不理想，部分早期患者亦可出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此亟需尋找更有效的預(yù)測指標(biāo)。大量基礎(chǔ)和臨床研究顯示，外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是一個潛在的預(yù)后因素，并在乳腺癌中得到臨床證實(shí)[1－5]。我們既往的研究已經(jīng)證實(shí)改良免疫磁珠富集及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法(immunomagnetic enrichment and fluorescent immunocytochemistry，IME－FICC)檢測乳腺癌外周血中的CTCs是一種簡便、省時(shí)、敏感性及特異性均較高的方法[6，7]。本研究將改良 IME－FICC法應(yīng)用于檢測NPC患者外周血中的CTCs，并探索其臨床意義。

材料和方法

1 臨床資料

2008年1月－2008年12月，共收治76例初治鼻咽癌患者。所有入選病例均被臨床檢查及組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為I－IVb期的鼻咽癌患者，分期標(biāo)準(zhǔn)按照2002年AJCC(American Joint Committee on Cancer)制定的關(guān)于腫瘤分期的標(biāo)準(zhǔn)，在抽血前均未接受任何治療。76例鼻咽癌患者的病理類型均為WHO II/III型。I期接受根治性放療，II－IVb接受含鉑類的誘導(dǎo)化療2－3療程，后接受根治性的聯(lián)合鉑類的同期放化療(鼻咽部66－70 Gy/6.5－7周;頸淋巴結(jié)陽性給予根治量60－70 Gy/6－7周;頸部淋巴結(jié)陰性給予預(yù)防量50－56 Gy/5－5.5周)，見表1。另取20例正常志愿者的外周血標(biāo)本作為陰性對照。中位隨訪25(范圍:5 －35)個月后，有17例患者復(fù)發(fā)，13例復(fù)發(fā)部位在鼻咽和/或頸部，3例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，1例鼻咽和/或頸部+遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。7例死亡，均死于腫瘤復(fù)發(fā)。

表1 76例鼻咽癌患者臨床特征Table 1.Clinical characteristics of NPC patients(n=76)

2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器

2.1 主要試劑 CNE1的鼻咽癌細(xì)胞株由美國ATCC細(xì)胞庫提供。0.25%的胰酶、DMEM、胎牛血清和青霉素/鏈霉素購自 Life Technologies。Histopaque－1077購自 Sigma。

OncoQuest提供的上皮細(xì)胞回收試劑盒包括 :EpiSep玻片、免疫磁珠顆粒、生物素標(biāo)記的抗細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)8/18抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素溶液、熒光懸液(含ELF－97)、DAPI、預(yù)洗緩沖液、終止緩沖液、乙醇固定劑、沖洗緩沖液、陽性對照(緩沖液中固定了的CNE1細(xì)胞)和陰性對照(緩沖液中固定了的正常供者的PBMC)。

2.2 儀器與設(shè)備 Beckman離心機(jī)，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈臺，低速旋轉(zhuǎn)器和熒光顯微鏡及連接顯微鏡的數(shù)碼相機(jī)和電腦。

3 方法[6，7]

3.1 共采集15 mL肝素抗凝靜脈血(留取第2管血，以防止由于靜脈穿刺把皮膚表皮細(xì)胞帶進(jìn)血管中而造成的假陽性結(jié)果)。使用Histopaque－1077，利用密度梯度原理，分離單個核細(xì)胞。使用一種磁珠顆粒與抗上皮細(xì)胞黏附分子(epidermal cellular adhesion molecule，EpCAM)的抗體結(jié)合以辨認(rèn)表達(dá)EpCAM的單個核細(xì)胞。取50 μL磁珠顆粒加入950 μL細(xì)胞懸液中，孵育后使用特制的EpiSep玻片(玻片中央有一個橢圓形的加樣孔，玻片被固定在磁鐵板上，磁鐵板的中央有一塊長方形磁鐵，則加樣孔在磁鐵正上方)。將混合物加到玻片的加樣孔中。表達(dá)EpCAM的陽性細(xì)胞結(jié)合到磁珠上，被磁鐵吸住。隨后，用酒精固定，加生物素標(biāo)記的抗CK8/18抗體孵育，加鏈親和素－堿性磷酸酶溶液，孵育，洗滌。加熒光懸液(含ELF－97，一種酶標(biāo)的熒光物質(zhì)，是水溶性的，可發(fā)出弱藍(lán)熒光。被堿性磷酸酶酶解后，不溶于水，被特定波長的光照射后，可激發(fā)出強(qiáng)綠熒光)孵育，洗滌。最后，用DAPI孵育，熒光標(biāo)記胞核的雙鏈DNA，洗滌。每次分析都使用CNE1細(xì)胞及正常人分離出的外周血單個核細(xì)胞分別作為陽性和陰性對照。

3.2 在熒光成像顯微鏡下分析CK8/18+細(xì)胞 本研究使用一部裝備100W的汞燈作光源的熒光顯微鏡(Nikon)。為了區(qū)分DAPI發(fā)出的藍(lán)熒光及ELF97酶解反應(yīng)物發(fā)出的綠熒光，顯微鏡同時(shí)裝備了2個濾板，一個窄波段濾板可用于檢測DAPI發(fā)出的藍(lán)熒光;另一個寬波段濾板可用于檢測ELF97酶解反應(yīng)物發(fā)出的綠熒光。移動濾板到不同位置，就可觀察到被熒光染色的核發(fā)出的藍(lán)熒光及CK8/18發(fā)出的綠熒光，并能觀察到陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。使用裝備在顯微鏡上的彩色數(shù)碼相機(jī)成像，經(jīng)SPOT Advanced 3.4 for Windows(Diagnostic Instruments)軟件處理后，保存在計(jì)算機(jī)里。

4 病毒殼蛋白抗原(viral capsid antigen，VCAIgA)抗體滴度檢測方法

VCA－IgA免疫酶染色檢測試劑盒購自廣東中山生物工程公司。待檢血清用PBS從1∶5開始倍比稀釋，按說明書操作，以陽性結(jié)果的最低血清稀釋度作為血清內(nèi)相應(yīng)抗體的滴度[8]。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kaplan－Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log－rank檢驗(yàn)。復(fù)發(fā)與否、轉(zhuǎn)移與否、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與否組間的CK8/1818 CTCs和VCA－IgA中位數(shù)比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。CK8/18+CTCs不同水平間2年無復(fù)發(fā)率及2年生存率的比較采用Fisher精確概率法。VCA－IgA＜1∶80和≥1∶80兩組間2年無復(fù)發(fā)率和2年生存率比較采用卡方檢驗(yàn)。CK 8/18+CTCs以及VCA－IgA不同水平間中位無復(fù)發(fā)時(shí)間和中位總生存時(shí)間比較采用Gehan法。無復(fù)發(fā)和生存的多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(Forward LR)。

結(jié) 果

1 鼻咽癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特征

本研究使用這一檢測方法分析了76例臨床分期I－IVb期的初治鼻咽癌患者。圖1顯示了其中鼻咽癌患者外周血中的CK8/18+細(xì)胞，可見其表面覆蓋多個磁珠，在寬波段濾板，其胞漿因表達(dá)CK8/18蛋白而被染上綠熒光，而胞核(因含dsDNA而被DAPI染色)呈現(xiàn)強(qiáng)白光，在窄波段濾板，可見原胞核位置被染上藍(lán)熒光，且這一胞核較大，形狀不規(guī)則，而周圍的白細(xì)胞均未被染色。

2 檢測鼻咽癌患者外周血CK8/18+腫瘤細(xì)胞的敏感性及特異性

76例鼻咽癌患者的外周血中有63例檢測到CK8/18+細(xì)胞，陽性率為82.9%，20例正常志愿者外周血中無一例檢測到CK8/18+細(xì)胞，兩組差異顯著(P＜0.01)。本實(shí)驗(yàn)方法檢測外周血CK+腫瘤細(xì)胞的特異性為100%(20/20)。

3 治療前檢測的鼻咽癌患者外周血CK+腫瘤細(xì)胞和VCA－IgA抗體滴度對治療后復(fù)發(fā)的影響

復(fù)發(fā)與否患者治療前檢測的外周血CK+CTCs中位數(shù)分別為5(四分位數(shù)間距范圍5－6)和3(四分位數(shù)間距范圍1－4)，P＜0.01，差異顯著。但復(fù)發(fā)與否患者治療前檢測的中位VCA－IgA滴度無顯著差異，見表2。

表2 復(fù)發(fā)與否患者治療前CK8/18+循環(huán)腫瘤細(xì)胞及VCA－IgA抗體滴度對比Table 2.CK8/18+circulating tumor cells(CTCs)and VCAIgA antibody titers before treatment in the patients with(n=17)or without(n=59)relapse

4 治療前檢測的鼻咽癌患者外周血CK+腫瘤細(xì)胞對鼻咽癌患者復(fù)發(fā)率的影響

63例治療前外周血檢測到CK+腫瘤細(xì)胞的患者有17例治療后復(fù)發(fā)(27.0%)，而13例治療前沒檢測到 CK+腫瘤細(xì)胞的患者無1例復(fù)發(fā)(P＞0.05)。

治療前VCA－IgA滴度≥1∶80患者的復(fù)發(fā)率為25.0%(3/12)，而VCA－IgA滴度＜1∶80的復(fù)發(fā)率為21.9%(14/64)，P＞0.05。

5 生存率分析

治療前沒有檢測到外周血CK+腫瘤細(xì)胞患者的2年無復(fù)發(fā)生存率100%，治療前檢測到外周血CK+腫瘤細(xì)胞個數(shù)分別為1、2、3、4、5、6 的患者 2 年無復(fù)發(fā)生存率分別為 100%、100%、94.1%、71.4%、53.3%、44.4%，差異顯著(P＜0.01)，外周血CK+腫瘤細(xì)胞個數(shù)在3以上，無復(fù)發(fā)生存率逐漸下降;治療前沒有檢測到外周血CK+腫瘤細(xì)胞及檢測到CK+腫瘤細(xì)胞個數(shù)分別為1、2、3、4、5、6 的患者 2 年總生存率分別是 100%、100%、100%、100%、100%、80.0%、77.8%(P＞0.05)，外周血CK+腫瘤細(xì)胞個數(shù)在5以上，總生存率逐漸下降，見圖2。

治療前VCA－IgA＜1∶80及≥1∶80患者的2年無復(fù)發(fā)生存率分別為77.8%和80.6%(P＞0.05)，2年總生存率分別為88.9%和94.0%(P＞0.05)，均無顯著差異，見圖3。

6 單因素分析及Cox多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示治療前外周血CK+CTCs的檢測個數(shù)明顯影響了鼻咽癌患者的無復(fù)發(fā)生存率(P＜0.01)，把治療前CK+CTCs的檢測個數(shù)及患者的臨床參數(shù)納入Cox多因素分析模型中，結(jié)果顯示外周血CK+CTCs的檢測個數(shù)是影響患者無復(fù)發(fā)生存最重要的預(yù)后因子[P＜0.01;hazard ratio(HR)=3.320;95% confidence interval(CI)=2.073－5.318]，另外，療效及臨床分期也是影響患者無復(fù)發(fā)生存的重要的預(yù)后因子，見表3。

Figure 1.Circulating tumor cells detected in the peripheral blood of patients with nasopharyngeal cancer(×400).A:one CK8/18+cell was observed with long－pass UV filter;B:the cell nucleus(blue fluorescence)stained by DAPI was visible with narrow －pass UV filter.圖1 鼻咽癌患者外周血中檢測到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞

Figure 2.Relapse－free survival(A)and overall survival(B)with different numbers of CK+CTCs.圖2 CK+CTCs的無復(fù)發(fā)生存曲線及總生存曲線

Figure 3.Relapse－free survival(A)and overall survival(B)with different levels of serum VCA － IgA titers.圖3 不同血清VCA－IgA滴度的無復(fù)發(fā)生存曲線及總生存曲線

表3 無復(fù)發(fā)生存的Cox多因素分析Table 3.Summary of relapse－free survival analyses by multivariate Cox proportional hazards model(n=76)

總生存的單因素分析結(jié)果顯示治療前外周血CK+CTCs的檢測個數(shù)、年齡、療效、臨床分期明顯影響了鼻咽癌患者的總生存(分別為 P＜0.01、P＜0.05、P ＜0.01、P ＜0.05);把治療前 CK+CTCs的檢測個數(shù)及患者的臨床參數(shù)納入Cox多因素分析模型中，結(jié)果顯示外周血CK+CTCs的檢測個數(shù)及年齡是影響患者總生存的重要預(yù)后因子(P＜0.05;HR=3.639;95%CI=1.303－10.158;P=0.050;HR=5.190;95%CI=1.001－26.904)，見表4。

表4 總生存的Cox多因素分析Table 4.Summary of overall survival analyses by multivariate Cox proportional hazards model(n=76)

討 論

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NPC治療失敗的主要原因，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是目前判斷NPC預(yù)后的重要因素。然而，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)對預(yù)后的預(yù)測準(zhǔn)確率并不理想，部分早期患者亦可出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此亟需尋找更有效的預(yù)測指標(biāo)。大量基礎(chǔ)和臨床研究顯示，外周血中檢測到的腫瘤細(xì)胞是一個潛在的預(yù)后因素[1－5]。

檢測實(shí)體腫瘤微轉(zhuǎn)移的方法主要有免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC)、分子生物學(xué)技術(shù)(PCR等)及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)。目前為止，ICC仍是檢測上皮性惡性腫瘤患者骨髓與外周血中微轉(zhuǎn)移細(xì)胞的最普遍、最成熟、最標(biāo)準(zhǔn)的方法。而檢測癌癥患者骨髓或外周血中腫瘤細(xì)胞最廣泛使用的標(biāo)志物就是CK，是表皮細(xì)胞或表皮細(xì)胞來源的癌細(xì)胞胞漿內(nèi)的細(xì)胞骨骼蛋白的主要組成成分。已有大量臨床研究證實(shí)，CK是檢測乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和喉鱗癌的一個特異性較高的標(biāo)志物[9，10]。我們的前期研究結(jié)果顯示在ICC的基礎(chǔ)上，將傳統(tǒng)的免疫磁珠富集及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，使用特制的專有EpiSep玻片和熒光雙標(biāo)循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)，其敏感性較高，可在107的外周血單個核細(xì)胞中檢測到1個腫瘤細(xì)胞，且簡單、快捷，特異性高達(dá)100%，在正常人的外周血中未檢測到CK8/18+細(xì)胞，與上述方法比較，該方法具有較高的敏感性和特異性[6，7]。本研究也在正常人的外周血中未檢測到CK8/18+細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的特異性。

本研究使用改良IME－FICC法檢測治療前鼻咽癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，比較了復(fù)發(fā)與否患者治療前檢測的鼻咽癌患者外周血CK+CTCs中位數(shù)，兩者差異顯著。但復(fù)發(fā)與否患者治療前檢測的中位VCA－IgA滴度無顯著差異。外周血CK+腫瘤細(xì)胞個數(shù)在3以上，無復(fù)發(fā)生存率逐漸下降。外周血CK+腫瘤細(xì)胞個數(shù)在5以上，總生存率有下降趨勢，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VCA－IgA滴度不能預(yù)測生存。Cox多因素分析結(jié)果也一樣。

其他一些學(xué)者亦報(bào)道了使用類似檢測方法檢測惡性腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究結(jié)果。Liu等[11]對轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)系統(tǒng)治療期間CTCs和FDG－PET/CT監(jiān)測的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行了比較。開始新的一系列治療并且在基線以及治療期間9到12周(治療中)接受了CTCs計(jì)數(shù)和FDG－PET/CT掃描檢查的MBC患者進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性分析。按照治療中CTCs計(jì)數(shù)結(jié)果[好(＜5個CTCs/7.5 mL血液)或差(≥5個CTCs/7.5 mL血液)]，對患者進(jìn)行了分類。對治療中的CTCs計(jì)數(shù)和FDG－PET/CT反應(yīng)進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在102名可評價(jià)的患者中，中位總生存時(shí)間是14個月(范圍:1到＞41個月)。在102名可評價(jià)患者的68名(67%)中，治療中CTCs水平與FDG－PET/CT反應(yīng)有關(guān)。在單變量分析中，治療中CTCs計(jì)數(shù)和FDG－PET/CT反應(yīng)可預(yù)測總生存期(分別P＜0.01和P＜0.01)。在34名治療中CTCs少于5個的不一致患者中的31名(91%)，F(xiàn)DG－PET/CT可預(yù)測總生存期(P＜0.01)。在多變量分析中，僅治療中CTC水平保持顯著(P＜0.01)。該研究結(jié)果顯示除了代謝反應(yīng)之外，治療監(jiān)測期間檢測到5個或更多的CTCs可準(zhǔn)確預(yù)測MBC的預(yù)后。Okegawa等[12]使用CellSearch系統(tǒng)(另一種免疫磁珠富集結(jié)合熒光雙標(biāo)方法)，對循環(huán)腫瘤細(xì)胞是否能夠預(yù)測激素難治性前列腺癌患者的生存期進(jìn)行了評價(jià)。此系統(tǒng)利用基于上皮細(xì)胞黏附前列腺癌抗體的免疫磁性捕捉和自動染色方法開發(fā)。對從64名激素難治性前列腺癌患者采集的血樣進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示在64名患者中，32名患者(50%)有至少5個循環(huán)腫瘤細(xì)胞，他們的中位總生存期是13.0個月，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量少于5個的患者中位總生存期為20.0個月(P＜0.01)。根據(jù)單變量分析和多變量分析，循環(huán)腫瘤細(xì)胞和前列腺特異性抗原倍增時(shí)間是預(yù)測總生存期有意義的參數(shù)。與在開始循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測之后，從腫瘤細(xì)胞水平未升高轉(zhuǎn)變?yōu)樯叩幕颊呦啾龋瑥纳咿D(zhuǎn)變?yōu)槲瓷叩幕颊?，總生存期較長(P＜0.05)。該研究結(jié)果表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能是激素難治性前列腺癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)測因素。

由于早中期鼻咽癌患者的生存期較長，到本研究截止時(shí)間(2010年12月31日)，76例患者中位隨訪時(shí)間25個月，最短5個月，最長35個月，目前大部分患者仍在隨訪當(dāng)中，經(jīng)過初步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示外周血中的CK8/18+循環(huán)腫瘤細(xì)胞是初治鼻咽癌患者較重要的預(yù)后因子，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)及延長隨訪時(shí)間，進(jìn)一步驗(yàn)證外周血中CK+循環(huán)腫瘤細(xì)胞在初治鼻咽癌患者的臨床意義。該方法經(jīng)驗(yàn)證后可成為國際上預(yù)測鼻咽癌復(fù)發(fā)及血道轉(zhuǎn)移早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)，并有利于指導(dǎo)該類患者采用何種治療方案并觀測療效。

總的來說，我們使用前期發(fā)展的這個新的檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，初步驗(yàn)證了鼻咽癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率與患者無復(fù)發(fā)生存及總生存有關(guān)，而VCA－IgA滴度不能預(yù)測生存。到目前為止，國內(nèi)外還未見到類似的報(bào)道。

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