竇橙云， 王蔚琛， 曹創(chuàng)杰， 魏樹珍， 李瑞峰△

(1山東大學醫(yī)學院病理生理學研究所，山東濟南250012;2濱州醫(yī)學院病理生理學教研室，山東煙臺264003;3濟南市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟南250013)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管病變導致的腎小球硬化，是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要并發(fā)癥之一，也是DM常見的死亡原因之一。DN發(fā)病機制復雜，目前普遍認為DN涉及遺傳因素、糖代謝異常、血流動力學異常、細胞因子調(diào)節(jié)障礙、炎癥介導、氧化應激等多因素多環(huán)節(jié)，最近硝化應激成為研究DN的熱點。

NO在眾多病理生理過程中發(fā)揮著介質(zhì)和信使的功能。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)時，高血糖激活誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)產(chǎn)生過量NO，與超氧陰離子(O－·2)反應生成過氧化亞硝酸鹽陰離子ONOO－，ONOO－與游離的酪氨酸或蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基反應生成3－硝基酪氨酸(3－nitrotyrosine，3－NT)。3－NT是體內(nèi)活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)的生物標志，其含量代表組織內(nèi)硝基化應激的水平。3－NT具有細胞毒性，對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和 DNA等具有很強的氧化能力，從而損傷組織。體外實驗證實因胰島素受體底物 －1(insulin receptor substrate－1，IRS－1)的酪氨酸殘基被ONOO－硝基化，導致胰島素轉(zhuǎn)導信號中斷，造成高糖血癥。但鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)所誘導的出生當天大鼠(neonatal－0 streptozotocin－induced rats，n0－STZ大鼠)體內(nèi)硝基化應激狀況及腎損害機制還鮮有報道。

本課題組前期研究顯示單用川芎嗪或單用氨基胍治療，無論在降低n0－STZ大鼠空腹血糖、血漿胰島素及胰島素抵抗指數(shù)方面，還是降低血漿NO水平、iNOS表達、糖化血清蛋白方面，均不及兩藥合用效果顯著[1]。本研究擬進一步觀察川芎嗪與氨基胍聯(lián)合應用對n0－STZ大鼠腎損害的保護效果與機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 出生當日的Wistar大鼠100只，體重約60 g，山東大學實驗動物中心提供。幼鼠先由母鼠喂養(yǎng)，4周齡后予普通飼料喂養(yǎng)，自由攝水攝食。室內(nèi)溫度控制在(22±3)℃，維持12/12 h的白天/黑夜交替。

1.2 試劑 STZ購于Sigma;氨基胍購于上海達瑞精細化學品有限公司;川芎嗪購于天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司;二甲雙胍由北京京豐制藥提供;3－NT(39－6)抗體為Santa Cruz產(chǎn)品;iNOSⅠ抗由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供;一氧化氮和一氧化氮合酶測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

2 方法

2.1 n0－STZ大鼠模型制備 出生當日的Wistar大鼠100只，隨機選取80只，一次性腹腔內(nèi)注射STZ 90 mg/kg，余20只作為正常對照組(NC)，腹腔內(nèi)注射等體積的生理鹽水。8周齡時，空腹血糖≥7.0 mmol/L者，選入本實驗。將n0－STZ大鼠隨機分為胰島素抵抗(IR)組、二甲雙胍(MET)治療組、川芎嗪+氨基胍(TMP+AG)聯(lián)合治療組，每組20只，繼續(xù)喂養(yǎng)。MET組每日經(jīng)飲水攝入二甲雙胍125 mg/kg;TMP+AG組每日經(jīng)飲水攝入川芎嗪50 mg/kg、氨基胍25 mg/kg;分雌雄2組喂養(yǎng)24周，觀察大鼠一般情況。

2.2 血液生化檢查 32周齡，全部大鼠摘取眼球采血處死，留取血清、血漿檢測空腹血糖(fasting plasm glucose，F(xiàn)PG)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)。根據(jù)公式IRI=(FPG×FINS)/22.5計算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，IRI)。酶學法檢測血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，Cr)。

2.3 尿液檢查 32周齡時，收集24 h尿液，測尿蛋白、尿肌酐。以內(nèi)生肌酐清除率反映腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR):GFR=(尿肌酐 × 尿量)/血肌酐。

2.4 NO活性和iNOS濃度檢測 10%腎組織勻漿，依次加入試劑充分混勻，490 nm(NO)或530 nm(iNOS)波長測各管吸光度值。

2.5 外周血白細胞iNOS mRNA檢測 提取白細胞，加入探針雜交液，anti－DIG －AP，NBT/BCIP，37℃避光顯色2 h，核固紅復染，封片。

2.6 HE染色 腎組織切片HE染色，觀察形態(tài)學變化。

2.7 免疫組化 常規(guī)脫蠟水化，Ⅰ抗4℃過夜(iNOS 1∶50;3 －NT 1∶100)，PBS 代替Ⅰ抗作陰性對照，DAB顯色。

2.8 Western blotting檢測 iNOS和3－NT 10%凝膠，加樣40 μg，電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、Ⅰ抗4 ℃過夜、Ⅱ抗37℃孵育1 h，暗室曝光顯影。

3 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 5軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間采用單因素方差分析，采用Kaplan－Meier法估計生存率，生存率曲線采用logrank檢驗進行假設檢驗。

結(jié) 果

1 n0－STZ大鼠成模情況

8周齡時，80只大鼠中有66只FPG≥7.0 mmol/L，成模率為82.5%，死亡率為0。該組大鼠尿量增多，體重增加，皮毛色黃、缺少光澤，活動量少，F(xiàn)PG、FINS和IRI明顯升高，接近IR疾病狀態(tài)。

2 各組大鼠生存率比較

32周齡時，NC組存活20只，存活率100%，IR組存活7只，存活率35%，MET組存活14只，存活率70%，TMP+AG組存活17只，存活率85%。IR組、MET組生存率明顯低于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組生存率明顯高于IR組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組間生存率差異無顯著，見圖1。

Figure 1.The survival curves of rats in different groups.圖1 各組大鼠生存率曲線

3 各組大鼠FPG、FINS和IRI的變化

32周齡時IR組的FPG明顯高于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組較IR組顯著下降(P＜0.05);IR組FINS高于NC組(P＜0.05)，TMP+AG組低于IR組(P＜0.05)，還低于MET組(P＜0.05)，但是高于NC組(P＜0.05)，表明和二甲雙胍相比，聯(lián)合治療更能顯著降低胰島素濃度;對于IRI，IR組明顯高于NC組，MET組和TMP+AG組遠低與IR組(P＜0.05)，但是TMP+AG組的療效優(yōu)于MET組(P＜0.05)，說明聯(lián)合治療在提高胰島素敏感性方面更具優(yōu)勢，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平Table 1.The levels of FPG，F(xiàn)INS and IRI of rats in different groups

4 各組大鼠腎功能變化

和NC組相比，IR組BUN、血Cr和尿蛋白的量顯著增加(P＜0.05)，GFR明顯下降(P＜0.05);MET組和TMP+AG組BUN、血清Cr、尿蛋白的量明顯低于IR組(P＜0.05)，GFR有所提高(P＜0.05);與MET組比較，TMP+AG組更能降低血清BUN、Cr和尿蛋白，提高腎小球的濾過功能(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清尿素氮、血清肌酐、尿蛋白、腎小球濾過率的比較Table 2. Comparison of BUN，serum Cr，urine albumin and GFR among different groups

5 各組大鼠NO濃度和iNOS活性變化

IR組的NO濃度和iNOS活性較NC組明顯增加(P＜0.05)，TMP+AG組在降低NO濃度和iNOS活性方面稍強于MET組(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The NO concentration(A)and iNOS activity(B)of rat in different groups.±s.NC:n=20;IR:n=7;MET:n=14;TMP+AG:n=17.*P ＜ 0.05 vs NC group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs MET group.圖2 各組NO濃度和iNOS活性比較

6 原位雜交

NC組外周血白細胞無iNOS mRNA表達，IR組外周血白細胞iNOS mRNA表達增高，MET組陽性率略低于IR組，TMP+AG組陽性率顯著降低，見圖3。

Figure 3.The iNOS mRNA －positive cells in peripheral blood leucocyte(×1 000).The dark blue cells were positive ones.A，B，C，D:NC(0.0±0.0)，IR(37.61% ±9.81%)，MET(20.85% ±5.17%)and TMP+AG(13.33% ±3.80%)groups，respectively.圖3 外周血白細胞iNOS mRNA陽性細胞

7 HE染色

NC組腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)完整，組織形態(tài)學正常，IR組腎小管萎縮、退化、排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生，腎小球體積增大，系膜基質(zhì)含量增加，治療組形態(tài)較IR組有明顯改變，聯(lián)合治療組的組織學形態(tài)向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變，見圖4。

Figure 4.The HE staining of kidneys and immunohistochemical staining of iNOS and 3－NT in kidneys(×400).PBS was a negative control instead of primary antibodies.A，B，C，D:NC，IR，MET and TMP+AG groups，respectively.圖4 各組腎臟組織HE染色，3－NT、iNOS免疫組化染色

8 免疫組化

3－NT:NC組中腎小管可見少量的棕黃色顆粒，腎小球中未見表達;IR組不僅棕黃色顆粒顯著增加，而且顆粒也增粗，但都集中在腎小管，腎小球仍未見。MET組的顆粒較IR組明顯減少，TMP+AG組的免疫染色較弱，接近于NC組，見圖4。

iNOS:NC組未見iNOS的表達，即棕黃色物質(zhì)的沉積。IR組腎小管中可見棕黃色物質(zhì)，MET組表達量減少，TMP+AG則明顯減少。4組腎小球中均未見表達，見圖4。

9 Western blotting結(jié)果

3－NT:NC組可表達一定量3－NT，但是IR組更多(P＜0.05);相較于IR組，MET組和TMP+AG組明顯減少(P＜0.05)，但MET組和TMP+AG組的差異不明顯，見圖5。

Figure 5.The expression of iNOS and 3－NT in each group.β－actin served as internal control.±s.NC:n=20;IR:n=7;MET:n=14;TMP+AG:n=17.*P ＜0.05 vs NC group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs MET group.圖5 各組腎組織中iNOS、3－NT、β－actin的表達結(jié)果

iNOS:NC組表達量非常少，IR組明顯提高(P＜0.05)，MET組比 IR組減少(P＜0.05)，TMP+AG組進一步減少(P＜0.05)，說明聯(lián)合治療在降低iNOS含量方面優(yōu)于二甲雙胍(P＜0.05)，見圖5。

討 論

對于糖尿病及其并發(fā)癥的研究，建立合理的動物模型非常重要。現(xiàn)階段誘導T2DM模型的方法多種多樣，包括食物喂養(yǎng)、藥物誘導、病毒感染、手術(shù)損傷、轉(zhuǎn)基因動物等。與傳統(tǒng)的成年動物模型不同的是，本研究用出生當日的Wistar大鼠。注射STZ后的結(jié)果顯示，F(xiàn)PG、FINS和IRI在造模8周后與 NC組相比明顯升高。該模型除了不具備遺傳易感性，其它特征與臨床IR及T2DM的早期表現(xiàn)非常接近，且價格低廉、生存率高、制備周期短，是研究IR發(fā)生發(fā)展及防治的理想模型[2]。32周齡時，和NC組相比，IR組血BUN、血Cr、尿蛋白的量顯著增加，GFR明顯下降，HE染色顯示腎小管萎縮、退化、排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生，腎小球體積增大，系膜基質(zhì)含量增加。給予川芎嗪與氨基胍聯(lián)合治療后，腎功能及其形態(tài)學損傷均得到明顯改善，提示聯(lián)合治療可以延緩或阻止糖尿病大鼠腎功能和病理學損害。

有關糖尿病腎功能受損的詳盡機制尚沒有完全闡明。尿蛋白是DN的標志，也是腎功能受損的一個重要的預測因子。國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)即使在DN的早期，足細胞的數(shù)目、密度以及細胞質(zhì)的覆蓋面積均明顯降低[3]，細胞間隙增大，微蛋白尿產(chǎn)生;巨噬細胞通過分泌白細胞介素 －1β(interleukin－1β，IL－1β)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)，激活磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路，參與蛋白尿的形成。高糖誘導產(chǎn)生的自由基下調(diào)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH －Px)的表達，激活 NF － κB[4]。NF － κB誘導糖尿病個體的腎小球系膜細胞、腎小管細胞、足細胞表達多種炎癥介質(zhì)，如TNF－α、IL－6，促進轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor－β1，TGF －β1)的釋放引起系膜細胞的增殖和腎小管纖維化，還可以導致腎臟炎癥級聯(lián)反應的加劇，進一步惡化腎功能。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對機體有益[5]，但過度時會通過TNF受體相關因子2(TNF receptor－associated factor 2，TRAF－2)、真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)－α和活化轉(zhuǎn)錄因子6(active transcriptional factor，ATF6)－PI3K/Akt通路激活 NF－κB，引起腎功能障礙。Drel等[6]發(fā)現(xiàn)多聚 ADP－核糖多聚酶(poly ADP－ribose polymerase，PARP)的活化提高了尿中丙二醛和3－NT含量，參與DN的發(fā)生。PARP抑制劑通過減輕足細胞的丟失和TGF－β的增加，阻止STZ－DM大鼠的蛋白尿、腎小球系膜的增生和膠原沉著[7]，也提示 PRAP參與DN的發(fā)生。本研究從NO、iNOS和3－NT三者間的相互關系出發(fā)，證實IR組不僅外周血白細胞iNOS mRNA表達增高，而且腎組織中NO濃度增加，iNOS活性升高，iNOS和3－NT表達增多。IR時不僅存在過多的NO，而且由于生成3－NT的過程中消耗了NO，造成iNOS活性升高，進一步刺激NO生成，形成惡性循環(huán)，進而加重腎功能損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍和聯(lián)合治療均能通過下調(diào)iNOS的活性，降低NO的濃度，減少3－NT的生成，明顯改善n0－STZ大鼠的腎功能，但聯(lián)合治療效果更優(yōu)，進一步佐證DN腎功能的損傷程度的確與硝化應激有關。但其藥理機制還未完全闡明。川芎嗪可降低糖尿病腎皮質(zhì)晚期糖晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)含量，抑制醛糖還原酶活性，調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白Bcl－2的表達，抑制腎臟細胞凋亡[8];減少 IL －6、TNF － α、TGF － β1等的表達，抑制成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成，延緩腎小球硬化[9];減少蛋白尿排泄，降低腎間質(zhì)中骨橋蛋白表達，從而減輕腎間質(zhì)損害[10]。氨基胍是iNOS的抑制劑，抑制NO生成;可抑制糖基化牛血清白蛋白(AGE－BSA)的生物效應，降低受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子水平，降低尿白蛋白，減輕腎系膜增生和腎小球肥大[11];抑制大鼠腎組織Ⅳ型膠原和TGF－β的表達，增強BMP－7和Smad5的表達，拮抗腎間質(zhì)的纖維化[12];增加二酰甘油(diacylglycerol，DAG)激酶活性，促使DAG轉(zhuǎn)化為磷脂酸，降低DAG水平，下調(diào)PKC活性而保護腎臟[13];減少腎小球乳過氧化物酶水平，降低腎臟氧化應激水平[14]。川芎嗪與氨基胍的聯(lián)合治療，不僅在抗氧化方面發(fā)揮協(xié)同作用，而且下調(diào)iNOS活性，抑制NO及3－NT生成，拮抗硝基化作用。聯(lián)合治療是否通過其它途徑緩解DN時的腎功能受損，還需要進一步研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪與氨基胍的聯(lián)合治療可減輕DN的腎功能損傷，其機制之一可能與抑制硝化應激有關，為DN發(fā)病機制的研究提供新的思路。

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