徐 霖， 納 寧， 陳 康， 曹開(kāi)源， 袁廣卿， 傅 強(qiáng)， 朱蓓莉

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院1 免疫學(xué)教研室3微生物學(xué)教研室，廣東 廣州510080;2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎移植科，廣東 廣州510630;4 東莞市衛(wèi)生學(xué)校，廣東 東莞523000)

移植物抗宿主病(graft－versus－h(huán)ost disease，GVHD)是同種異基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，allo－BMT)最主要的并發(fā)癥之一，在防治GVHD 的同時(shí)如何保留移植物抗白血病(graft－versus－leukemia，GVL)效應(yīng)是目前臨床上開(kāi)展骨髓移植和治療白血病需要解決的難題之一。研究表明某些特定亞群的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)如淋巴系DC，如小鼠CD8α+DC 或人的漿細(xì)胞樣DC，或者未成熟DC(immature dendritic cells，iDC)可以產(chǎn)生免疫耐受作用［1，2］。同時(shí)供者DC 也能提呈次要組織相容性抗原活化T 細(xì)胞，介導(dǎo)產(chǎn)生移植物抗白血病(graft－versus－leukemia，GVL)作用［1，3］。我們前期研究中探索和改進(jìn)了不成熟CD8α+DC 的制備方法［4－6］，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已證明其具有一定抑制GVHD 的作用，同時(shí)不增加白血病復(fù)發(fā)［2，7，8］，但其GVL 作用仍有待進(jìn)一步體外研究加以證實(shí)。因此本研究通過(guò)負(fù)載同種異基因白血病抗原的CD8α+DC 對(duì)同系T 細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和殺傷等進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察不成熟CD8α+DC 是否能產(chǎn)生GVL 效應(yīng)，為不成熟CD8α+DC 抗GVHD 并保留GVL 效應(yīng)的機(jī)制和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 DC 的培養(yǎng)［4－6］

不成熟CD8α+DC(CD8α+iDC)組:C57BL/6 小鼠(H－2b)骨髓細(xì)胞以4 ×109/L 的濃度種于6 孔板中，加入細(xì)胞因子GM－CSF 5 μg/L，IL－4 20 μg/L、SCF 100 μg/L、Flt3L 25 μg/L 誘導(dǎo)DC，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱誘導(dǎo)2 d，于培養(yǎng)第3 d收獲不成熟CD8α+DC 細(xì)胞。

成熟DC(mature DC，mDC)對(duì)照組［7，9］:按文獻(xiàn)報(bào)道方法，C57BL/6 小鼠(H－2b)骨髓細(xì)胞以1 ×109/L 的濃度種于6 孔板，加入細(xì)胞因子GM－CSF 20 μg/L 和IL－4 10 μg/L，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)誘導(dǎo)8 d。于培養(yǎng)第3 d，第5 d 換液，培養(yǎng)第7 d 加入細(xì)胞因子至終濃度為GM－CSF 10 μg/L和TNF－α 10 μg/L 繼續(xù)誘導(dǎo)促DC 成熟。

2 EL9611 紅白血病細(xì)胞全抗原的制備

EL9611 紅白血病動(dòng)物模型購(gòu)自天津中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，由丁順利等［10］建立。傳代采用每只BALB/c 鼠尾靜脈注射經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理的患鼠脾細(xì)胞2 ×106個(gè)，接種后小鼠平均存活時(shí)間(14.5 ±2.1)d，發(fā)病晚期(約12 d 左右)計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞(white blood cell，WBC)數(shù)目［2，10］。當(dāng)WBC ＞3.0 ×1010/L 時(shí)將動(dòng)物拉頸處死，取脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以1×1011/L 濃度重懸于PBS 中，置－80 ℃、37 ℃反復(fù)凍融5次，每次10 min。凍融后的細(xì)胞懸液用超聲破碎儀以600 W超聲10 min，間隔5 s 對(duì)樣品中所含DNA 進(jìn)行剪切，4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清用0.22 μm 的針頭濾器過(guò)濾，－20 ℃保存。

3 抗原沖擊與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)［7，8］

CD8α+iDC 組和mDC 對(duì)照組均于培養(yǎng)最后1 d 加入蛋白含量終濃度為0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 經(jīng)抽濾除菌的EL9611 紅白血病(H－2d)全抗原進(jìn)行沖擊，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，使DC 細(xì)胞提呈抗原成分。

MLR 以DC 作為刺激細(xì)胞，同系T 細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞。分組如下:實(shí)驗(yàn)組:每孔加2 ×105個(gè)反應(yīng)細(xì)胞，按與反應(yīng)細(xì)胞比例為1∶1、2∶1、4∶1(分別為2 ×105、4 ×105、8 ×105cells/well)加入經(jīng)終濃度25 mg/L 絲裂霉素處理2h 的刺激細(xì)胞，每組設(shè)3 個(gè)平行孔;刺激細(xì)胞對(duì)照組:每孔加2 ×105、4 ×105、8 ×105個(gè)經(jīng)絲裂霉素處理的刺激細(xì)胞，不加反應(yīng)細(xì)胞，每組設(shè)3 個(gè)平行孔;反應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組:未加刺激細(xì)胞的2 ×105個(gè)反應(yīng)細(xì)胞/well。空白組:每孔加100 μL 培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 d，采用MTT 法檢測(cè)。各實(shí)驗(yàn)孔A 值為減去反應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔A 值、刺激細(xì)胞對(duì)照孔A 值和培養(yǎng)基空白孔A 值后的A 值平均值。

4 MLR 培養(yǎng)上清中γ－干擾素(interferon－γ，IFN－γ)和白細(xì)胞介素－10(interleukin－10，IL－10)的檢測(cè)

收集混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA 法測(cè)定培養(yǎng)上清中IFN－γ 和IL－10 含量。試劑盒復(fù)溫30 min 后，各孔分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、適度稀釋的上清樣品及陰性對(duì)照。每組設(shè)3 個(gè)平行孔，100 μL/well，37 ℃濕盒孵育2 h，洗滌5 次;加入生物素抗體工作液100 μL/well，37 ℃1 h，洗滌5 次后加入酶結(jié)合工作液100 μL/well，37 ℃30 min，洗滌后加顯色劑100 μL/well，37 ℃顯色15 min;加終止液后10 min 內(nèi)于酶標(biāo)儀上450 nm 波長(zhǎng)處讀A 值。結(jié)果計(jì)算:標(biāo)準(zhǔn)品孔A 值和樣品孔A 值分別減去陰性對(duì)照孔A 值。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A 值和標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞因子含量繪制;樣品中細(xì)胞因子的含量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程進(jìn)行確定。

5 CD8α+iDC 誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞的活化

Ag 沖擊后的CD8α+iDC 經(jīng)絲裂霉素C 處理2h，DMEM完全培養(yǎng)基洗滌3 次后，計(jì)數(shù)備用。取靜置1 h 后去除巨噬細(xì)胞的C57BL/6(H－2b)的脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)，備用。根據(jù)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的結(jié)果，按CD8α+DC/T 1∶1 的比例，混合DC 和T 細(xì)胞后置于6 孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)第1 d、第3 d 加入終濃度為5 ×105U/L 重組小鼠IL－2維持T 細(xì)胞活性。以未加DC 刺激的C57BL/6 小鼠的T 細(xì)胞作為殺傷實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。

6 T 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 EL9611 抗原沖擊CD8α+iDC 實(shí)驗(yàn)組刺激同系小鼠T 細(xì)胞增殖的情況

EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖隨CD8α+iDC/T 刺激比例增加而增強(qiáng)，1∶1、2∶1 和4∶1 各比例組刺激T 細(xì)胞增殖的作用呈梯度增加，各組間差別顯著(P ＜0.05)，見(jiàn)圖1;在CD8α+iDC/T 比例為1∶1 組中，當(dāng)抗原沖擊濃度為2.5 mg/L 和5 mg/L 時(shí)刺激T 細(xì)胞增殖作用達(dá)到最大，且這2 種濃度之間無(wú)顯著差別(P ＞0.05)。在CD8α+iDC/T 比例為2∶1 和4∶1 組中，當(dāng)抗原沖擊濃度為5 mg/L 時(shí)刺激T 細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)。不同比例組在抗原沖擊濃度為20 mg/L 時(shí)，刺激T 細(xì)胞增殖的作用趨于平穩(wěn)。以上結(jié)果顯示低濃度抗原(≤5 mg/L)沖擊CD8α+iDC 后刺激T 細(xì)胞增殖的作用較強(qiáng)，采用低濃度抗原沖擊可能更有利于CD8α+iDC 的GVL 效應(yīng)。

2 EL9611 抗原沖擊mDC 對(duì)照組刺激同系小鼠T 細(xì)胞增殖的情況

EL9611 抗原沖擊后mDC 刺激T 細(xì)胞增殖趨勢(shì)與CD8α+iDC 組類(lèi)似，隨mDC/T 比例的增加，T 細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，各比例組間的差別顯著(P ＜0.05)，見(jiàn)圖2。各比例組均在抗原沖擊濃度為20 mg/L 時(shí)顯示最弱的刺激T 細(xì)胞增殖能力(P ＜0.05);其它各抗原沖擊濃度組(0 mg/L、2. 5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L)刺激T 細(xì)胞增殖的能力無(wú)顯著差別(P ＞0.05)，抗原濃度的變化對(duì)mDC 刺激T 細(xì)胞增殖能力的影響不明顯。

Figure 1. The proliferation of syngeneic T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed CD8α+iDC in DC/T ratio of 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs CD8α+ iDC/T 1∶1 group.圖1 EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC/T 1∶1、2∶1 和4∶1 組刺激T 細(xì)胞增殖情況

Figure 2. The proliferation of syngeneic T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed mDC in DC/T ratio of 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs mDC/T 1∶1 group.圖2 EL9611 抗原沖擊的mDC/T 1∶1、2∶1 和4∶1 組刺激T細(xì)胞增殖情況

3 CD8α+iDC 與mDC 不同比例、不同濃度時(shí)對(duì)T 細(xì)胞刺激能力的比較

從圖1、2 可以看出，CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖能力與沖擊抗原濃度有關(guān)，在抗原濃度2.5－5 mg/L 時(shí)達(dá)到最大，但mDC 未顯示此趨勢(shì)。未經(jīng)EL9611 H－2d紅白血病抗原沖擊(即抗原沖擊濃度為0 mg/L)時(shí)，在DC/T 的各比例組中CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖的能力均低于mDC(P ＜0.05)。當(dāng)抗原沖擊濃度為2.5－5 mg/L 時(shí)，CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖的能力各比例組中均高于mDC 對(duì)照組(P ＜0.05);當(dāng)抗原沖擊濃度為10 mg/L 時(shí)，CD8α+iDC 各比例組刺激T 細(xì)胞增殖的能力均弱于mDC(P ＜0.05);而當(dāng)抗原沖擊濃度進(jìn)一步增加，達(dá)到20 mg/L 時(shí)，二者之間差別無(wú)顯著(P ＞0.05)。結(jié)果進(jìn)一步表明低濃度抗原沖擊CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖的效果較好。

4 EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)后IFN－γ 和IL－10 的分泌情況

EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，上清液細(xì)胞因子ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，CD8α+iDC 經(jīng)抗原沖擊后DC 細(xì)胞本身釋放一定量的IFN－γ 和IL－10，上清液中IFN－γ 含量為(28.9 ±4.5)ng/L，IL－10 含量為(45.5 ±11.0)ng/L。經(jīng)與T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD8α+iDC/T 不同比例組分泌IFN－γ 和IL－10 水平均明顯增高，差別顯著(P ＜0.05)。IL－10 的分泌在抗原沖擊濃度為10 mg/L 時(shí)達(dá)最高值，與其它濃度組比較差別顯著(P ＜0.05);而在抗原沖擊濃度為2.5 mg/L 和5 mg/L 時(shí)在各比例組中均達(dá)最低值(P ＜0.05)，見(jiàn)圖3、4。IFN－γ 的分泌在抗原沖擊濃度為2.5 mg/L 時(shí)濃度最高，而后顯示出下降趨勢(shì)，在1∶1 和2∶1 組當(dāng)抗原濃度為5 mg/L 時(shí)分泌量最低(P ＜0.05)。結(jié)果提示，當(dāng)沖擊抗原濃度為低濃度時(shí)(≤5 mg/L)時(shí)，IFN－γ 的分泌量較高而IL－10較低，較低的抗原沖擊濃度可能更有利于CD8α+iDC 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)揮GVL 效應(yīng)，結(jié)果與增殖實(shí)驗(yàn)一致。

綜合細(xì)胞因子分泌和增殖反應(yīng)的情況，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原沖擊為5 mg/L 時(shí)，IL－10 分泌最低，T 細(xì)胞增殖活性達(dá)最大值;當(dāng)抗原沖擊濃度為10 mg/L 時(shí)，IL－10 分泌最高，此時(shí)T 細(xì)胞增殖活性達(dá)最低，說(shuō)明EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC刺激T 細(xì)胞的增殖活性與IL－10 的含量密切相關(guān)，這也提示IL－10 的分泌與CD8α+iDC 發(fā)揮GVL 效應(yīng)存在一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

Figure 3. Secretion of IFN－γ by T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed CD8α+iDC. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs CD8α+iDC/T 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups.圖3 EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞分泌IFN－γ 的情況

Figure 4. Secretion of IL－10 by T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed CD8α+iDC. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs CD8α+iDC/T 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups.圖4 EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞分泌IL－10 的情況

5 EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC 刺激同系T 細(xì)胞的殺傷活性

MLR 結(jié)果和細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，EL9611 抗原沖擊濃度≤5 mg/L，EL9611 抗原沖擊CD8α+iDC/T 比例為1∶1 時(shí)，特異性T 細(xì)胞活化效果最佳，故以此條件作為殺傷實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件。

EL9611 靶細(xì)胞特異性殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，殺傷率隨抗原沖擊濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)沖擊濃度為2.5 mg/L 時(shí)，殺傷率即可達(dá)90%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷作用，表明CD8α+iDC 經(jīng)同種異基因白血病抗原沖擊后能夠有效提呈白血病細(xì)胞的抗原成分，發(fā)揮GVL 效應(yīng)，見(jiàn)圖5。EL9611 抗原特異性T 細(xì)胞對(duì)BALB/c正常脾細(xì)胞的非特異性殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白血病特異T 細(xì)胞對(duì)正常脾細(xì)胞不產(chǎn)生顯著的殺傷作用，其殺傷率低于T 細(xì)胞陰性對(duì)照(未經(jīng)CD8α+iDC 刺激的T 細(xì)胞，P ＜0.05)，見(jiàn)圖6，表明白血病特異性T 細(xì)胞在殺傷白血病細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的殺傷作用，其殺傷為抗原特異性殺傷，在清除白血病細(xì)胞的同時(shí)不引起正常細(xì)胞的損傷。

Figure 5. Specific cytotoxicity of EL9611 antigen－specific T cells on EL9611 cells. ±s.n=3.圖5 EL9611 抗原特異性T 細(xì)胞對(duì)EL9611 細(xì)胞的特異性殺傷實(shí)驗(yàn)

Figure 6. Non－specific cytotoxicity of EL9611 antigen－specific T cells on BALB/c splenocytes.. ±s.n=3.圖6 EL9611 抗原特異性T 細(xì)胞對(duì)BALB/c 脾細(xì)胞的非特異性殺傷實(shí)驗(yàn)

討 論

本課題組在前期研究中已通過(guò)GM－CSF+IL－4 +SCF+Flt3L 組合的方式成功制備出CD8α+iDC［4－6］，體外實(shí)驗(yàn)表明其具有體外抑制同種MLR 的作用［7，8］，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同種異基因骨髓移植同時(shí)輸注CD8α+iDC 可減輕GVHD 病理?yè)p傷，延長(zhǎng)小鼠存活期，同時(shí)不增加白血病復(fù)發(fā)［2］，推測(cè)CD8α+iDC 可能保留了部分GVL 效應(yīng)。故本研究在不成熟CD8α+DC 抑制GVHD 作用機(jī)制體外研究的基礎(chǔ)上［7，8］，進(jìn)一步探討CD8α+iDC 體外是否能夠產(chǎn)生一定的GVL 效應(yīng)。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沖擊抗原濃度對(duì)CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖的能力有較明顯的影響，但mDC 刺激T 細(xì)胞增殖的能力較穩(wěn)定，抗原濃度對(duì)其影響較小。未經(jīng)同種異基因白血病抗原沖擊之前，CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖的作用明顯弱于mDC 對(duì)照組，但經(jīng)小劑量(≤5 mg/L)抗原沖擊后其刺激T 細(xì)胞增殖的作用高于mDC。CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖的能力隨CD8α+iDC/T 刺激比例增加而增強(qiáng)，在CD8α+iDC/T 比例為1∶1 而抗原沖擊濃度為2.5 mg/L、5 mg/L 時(shí)刺激T 細(xì)胞增殖的作用達(dá)到最大。因此，要最大限度地發(fā)揮CD8α+iDC抗GVHD 并保留GVL 效應(yīng)時(shí)，低濃度抗原刺激將更有優(yōu)勢(shì)。

對(duì)CD8α+iDC 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沖擊抗原濃度為低濃度時(shí)(≤5mg/L)時(shí)，IFN－γ的分泌量較高而IL－10 較低，故較低的抗原沖擊濃度可能更有利于CD8α+iDC 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)揮GVL 效應(yīng)。而綜合細(xì)胞因子分泌和增殖反應(yīng)結(jié)果后可以發(fā)現(xiàn)，上清中IL－10含量與CD8α+iDC 刺激T 細(xì)胞增殖的作用存在一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示IL－10 的分泌CD8α+mDC 抑制GVHD 并同時(shí)保留GVL 效應(yīng)的平衡這一作用之間存在著密切的聯(lián)系，體系中保持合適濃度的IL－10 有利于產(chǎn)生抗GVHD 并同時(shí)保留GVL 的效應(yīng)。雖然受者EL9611 紅白血病抗原沖擊后的CD8α+iDC 和mDC 都能夠刺激T 細(xì)胞增殖，但CD8α+iDC 由于能產(chǎn)生更多IL－10，能更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，在GVHD防治中更具有應(yīng)用價(jià)值。

殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EL9611 白血病抗原沖擊的CD8α+iDC 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)，當(dāng)沖擊濃度為2.5 mg/L 時(shí)，T 細(xì)胞對(duì)EL9611 靶細(xì)胞的殺傷率即可達(dá)90%，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的殺傷作用。刺激增殖后的T 細(xì)胞能有效發(fā)揮殺傷紅白血病靶細(xì)胞的作用，同時(shí)不引起對(duì)正常細(xì)胞的非特異性殺傷，提示CD8α+iDC 在發(fā)揮GVL 的同時(shí)不會(huì)引起正常組織的損傷，殺傷作用具有抗原特異性。當(dāng)抗原沖擊濃度為0 即未用抗原沖擊時(shí)，CD8α+iDC 即可刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，但這一作用是抗原非特異性的，從非特異性殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得到驗(yàn)證。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CD8α+iDC 能夠提呈同種異基因的EL9611 白血病細(xì)胞抗原并產(chǎn)生特異性GVL 效應(yīng)。

綜上所述，CD8α+iDC 可有效刺激抗原特異性T 細(xì)胞增殖并產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)，所具有的GVL 作用為CD8α+iDC在GVHD 防治中的進(jìn)一步應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)，使其有可能成為抗GVHD 同時(shí)保留GVL 作用的一種治療手段，在同種異基因骨髓移植中顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值。

［1］ Toubai T，Malter C，Tawara I，et al. Immunization with host－type CD8α+dendritic cells reduces experimental acute GVHD in an IL－10－dependent manner［J］. Blood，2010，115(3):724－735.

［2］ Xu L，Duan LN，Cao KY，et al. Predominant immature CD8α+dendritic cells prevent graft－versus－h(huán)ost disease but do not increase the risk of leukemia recurrence［J］.Eur J Haematol，2007，78(3):235－245.

［3］ Xia G，Truitt RL，Johnson BD. Graft－versus－leukemia and graft－versus－h(huán)ost reactions after donor lymphocyte infusion are initiated by host－type antigen－presenting cells and regulated by regulatory T cells in early and long－ term chimeras［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2006，12(4):397－407.

［4］ Na N，Xu L，Cao KY，et al. Optimal in vitro culture conditions for murine predominant immature CD8α+dendritic cells［J］.Chin Med J (Engl)，2009，122(3):344－348.

［5］ 鄧玉蘭，彭延文，徐 霖，等. 不同級(jí)別小鼠來(lái)源的骨髓細(xì)胞對(duì)制備優(yōu)勢(shì)DC2 影響的研究［J］. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009，9(2):54－57.

［6］ 納 寧，羅 云，洪良慶，等. 四種細(xì)胞因子組合從小鼠骨髓細(xì)胞體外誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)不成熟CD8α+DC［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2008，29(2):126－130.

［7］ 陳 康，曹開(kāi)源，徐 霖，等. 同種異型抗原沖擊不成熟CD8α+DCs 抑制T 細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn)［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2010，26(11):2202－2206.

［8］ 納 寧，徐 霖，曹開(kāi)源，等. 小鼠不成熟CD8α+樹(shù)突狀細(xì)胞的體外功能研究［J］. 中華器官移植雜志，2011，32(1):6－10.

［9］ Basak SK，Haru IA，Stolina M，et al. Increased dendritic cell number and function following continuous in vivo in fusion of granulocyte macrophage－colony－stimulating factor and interleukin－4［J］. Blood，2002，99(8):2869－2879.

［10］ 丁順利，褚建新，趙鈞銘，等. 可移植性BALB/c 小鼠紅白血病模型的建立及其生物學(xué)特性［J］.中華血液學(xué)雜志，1998，19(12):638－641.