鐘 鑫， 賈洪麗， 侯俊青， 王育文， 時(shí) 颯， 李志韜

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)1病理生理教研室，黑龍江生物醫(yī)藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江哈爾濱150081)

NO影響心臟功能的作用已經(jīng)被廣泛報(bào)導(dǎo)，而作為它的去電子形式 －硝酰基(nitroxyl，HNO)對(duì)心臟功能的影響最近才被關(guān)注[1]。HNO在正常及衰竭[2，3]心臟都起到正性、非負(fù)荷依賴(lài)性肌力作用。研究表明HNO具備β受體激動(dòng)劑的作用且不被β受體阻滯劑所阻斷。NO或硝酸鹽所產(chǎn)生的HNO在體內(nèi)對(duì)心血管活動(dòng)作用非常明顯，因?yàn)楹笳咴陟o息心肌上只表現(xiàn)適度的正性肌力效應(yīng)[4]。與NO不同的是，如果細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量的含量增加，HNO活性則明顯減低甚至消失[10]，該結(jié)果支持了HNO基本化學(xué)作用中以硫基為靶點(diǎn)的論斷[1]。

HNO生理作用表明其可以作為心衰的一種新型治療手段，同時(shí)增加了對(duì)心衰細(xì)胞和分子機(jī)制進(jìn)一步的理解。HNO能夠刺激鈣離子從心肌及骨骼肌[5]的ryanodine受體 (RyR)釋放。在心肌細(xì)胞，最初研究資料表明此作用是不依賴(lài)cGMP及cAMP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式[6]。除對(duì)鈣離子影響之外，HNO也可能與原肌球蛋白(tropomyosin，Tm)相互作用改變其收縮反應(yīng)。NO及其相關(guān)物質(zhì)如過(guò)亞硝酸鹽[7，8]則以cGMP依賴(lài)的方式減低肌原纖維對(duì)鈣離子的反應(yīng)能力。HNO在可調(diào)節(jié)性細(xì)肌絲和/或肌原纖維蛋白上可能作用于巰基靶點(diǎn)改變張力的產(chǎn)生。

以往研究使用HNO供體，Angeli’s salt(AS)。AS不是純HNO供體，而是同時(shí)釋放HNO和亞硝酸鹽[9]。亞硝酸鹽不刺激心肌產(chǎn)生收縮性反應(yīng)，在體內(nèi)主要導(dǎo)致血管舒張[3]。乙酸1－亞硝基環(huán)已酯(1－nitrosocyclohexyl acetate，NCA)不釋放亞硝酸鹽，是較純的HNO供體，其發(fā)展將對(duì)HNO生化作用及機(jī)制進(jìn)行更有效的分析。目前的研究用來(lái)檢測(cè)NCA是否改變了肌原纖維對(duì)鈣離子的反應(yīng)能力。應(yīng)用完整的大鼠梳狀肌，觀察了HNO供體NCA對(duì)心臟興奮 －收縮偶聯(lián)的影響。我們發(fā)現(xiàn)NCA以劑量依賴(lài)的方式增加[Ca2+]i水平及心肌收縮力，同時(shí)增強(qiáng)肌原纖維對(duì)鈣離子的反應(yīng)性。NCA效應(yīng)被還原劑二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DTT)阻斷，支持硫醇鹽在此過(guò)程中發(fā)揮靶點(diǎn)角色的論斷。

材料和方法

1 動(dòng)物及試劑

20只Sprague－Dawley大鼠，體重250－300g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;NCA由美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)高衛(wèi)東實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

2 梳狀肌制備

大鼠腹腔注射戊巴比妥 (100 mg/kg)麻醉，沿胸骨中部切開(kāi)暴露心臟，迅速摘除心臟并將其放置在標(biāo)本盤(pán)中。室溫下(21－22℃)進(jìn)行主動(dòng)脈插管并用含有95%O2及5%CO2的解剖Krebs－Henseleit(K－H)液逆行灌流。K－H液組成(mmol/L):NaCl 120，NaHCO320，KCl 5，MgCl21.2，葡萄糖10，CaCl20.5 及2，3 － 丁二酮 20，pH 7.35 － 7.45。取自于右心室的梳狀肌置于張力換能器和刺激電極之間。然后，對(duì)其進(jìn)行K－H液表面灌流(10 mL/min)，同時(shí)給予頻率為0.5 Hz的刺激。解剖顯微鏡下 (×40，分辨率10 μm)標(biāo)準(zhǔn)刻度線測(cè)量梳狀肌的尺寸。

3 張力及肌小節(jié)長(zhǎng)度的測(cè)定

應(yīng)用張力換能系統(tǒng) (KG7，Scientific Instruments GmbH)對(duì)收縮力進(jìn)行測(cè)量并以mN/mm2橫斷面積來(lái)表示。肌小節(jié)長(zhǎng)度通過(guò)激光衍射法[10]進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)網(wǎng)狀二極管線陣系統(tǒng) (RC0100－RG512，EG＆G Reticon)檢測(cè)肌肉中部衍射光線。衍射的初級(jí)光強(qiáng)度被整合，應(yīng)用定制的肌小節(jié)長(zhǎng)度檢測(cè)系統(tǒng)(University of Calgary)測(cè)出光強(qiáng)度分布中值，從而決定肌小節(jié)長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中靜息肌小節(jié)長(zhǎng)度設(shè)定為2.2 －2.3 μm。

4 [Ca2+]i測(cè)定

應(yīng)用Fura－2游離酸的形式對(duì)[Ca2+]i進(jìn)行測(cè)定[11]。Fura－2鉀鹽采用離子透入法用玻璃電極顯微注射入一個(gè)細(xì)胞，經(jīng)縫隙連接擴(kuò)散至整個(gè)肌組織。微電極頂端 (直徑0.2 μm)充滿Fura－2鹽溶液 (1 mmol/L)，其余部分用150 mmol/L KCl充滿。在靜息肌組織中成功用微電極刺入表面細(xì)胞后，不間斷傳送5－10 nA超極化電流15 min。在一些肌組織不同部位可以重復(fù)注射 (最多3－4次)，每個(gè)部位注射持續(xù)時(shí)間 ＜10 min以達(dá)到較好的信噪比。如前所述:此負(fù)載不影響張力發(fā)展[11]。Fura－2回波熒光在380 nm及340 nm激發(fā)并測(cè)定，在510 nm用光電倍增管 (R1527，Hamamatsu)收集熒光并進(jìn)行數(shù)字化分析。通過(guò)下列方程得出[Ca2+]i(減去自發(fā)熒光):[Ca2+]i=K’d(R － Rmin)/(Rmax－R)。R是實(shí)測(cè)的熒光率 (340/380)，K’d是表觀解離常數(shù)，Rmax是[Ca2+]i飽和時(shí)340 nm/380 nm 比率，Rmin是[Ca2+]i為 0時(shí) 340 nm/380 nm 比率。K’d，Rmax及 Rmin的值由前述體內(nèi)校準(zhǔn)法[11]所決定。

5 梳狀肌穩(wěn)態(tài)激活作用及去肌膜心肌組織收縮力的測(cè)定

Ryanodine(1.0 μmol/L)應(yīng)用于穩(wěn)態(tài)激活作用。暴露于 ryanodine 15 min后，在多種[Ca2+]o(0.5－20.0 mmol/L)下以10 Hz頻率刺激肌組織，不同水平的強(qiáng)直被暫時(shí)(4－8 s)誘導(dǎo)出現(xiàn)。1%Txiton X－100應(yīng)用于梳狀肌去肌膜反應(yīng)。心肌組織被1%Txiton X －100作用10 min后，膜性結(jié)構(gòu)破壞，僅保留蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在室溫下(20－22℃)進(jìn)行。

6 Western blotting檢測(cè)

取右心室心肌組織蛋白提取液，室溫下SDSPAGE電泳，4℃轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，常規(guī)洗脫，相應(yīng)Ⅰ抗 (1∶3 000稀釋)和Ⅱ抗 (1∶2 000稀釋)孵育，反復(fù)洗膜后堿性磷酸酶試劑顯色。Quality圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫印記結(jié)果進(jìn)行定量分析。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 NCA增加完整大鼠梳狀肌收縮力的作用強(qiáng)于增加[Ca2+]i效應(yīng)

圖1可見(jiàn)，給予NCA出現(xiàn)典型的收縮力及相應(yīng)的[Ca2+]i變化。收縮力的增強(qiáng)不是由于K －H緩沖液的堿化所致，因?yàn)闄z測(cè)緩沖液pH不發(fā)生變化。圖1顯示收縮力增強(qiáng)而舒張力變化不明顯，同時(shí)，收縮期[Ca2+]i增加而舒張期[Ca2+]i不變。兩者均增加的情況下，收縮期力的增加比收縮期[Ca2+]i變化更為顯著，該結(jié)果支持NCA增加肌原纖維對(duì)鈣離子的敏感性。

Figure 1.Changes of force(B，D)and[Ca2+]itransient(A，C)treated with various concentrations of NCA.A，B:time－course changes;C，D:changes in systolic and diastolic phases.Temperature:22 ℃;sarcomere length=2.2 μm;[Ca2+]o=0.5 mmol/L±s.n=8－9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs before drug.圖1 收縮力與[Ca2+]i的變化

不同頻率條件下 (0.5－3.0 Hz)同對(duì)照組相比，NCA處理組始終表現(xiàn)明顯更高的收縮力(P＜0.01)，而[Ca2+]i變化則無(wú)明顯差別 (P ＞0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Changes of force(A)and[Ca2+]itransient(B)at different frequencies(0.5－3.0 Hz)before and after NCA treatment.Experimental temperature was 22℃.Sarcomere length was set at 2.2 μm and[Ca2+]o=0.5 mmol/L.±s.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 收縮力－頻率相互關(guān)系

2 NCA增加完整大鼠梳狀肌對(duì)鈣離子的反應(yīng)性

對(duì)照組最大鈣離子活化張力為(90.0±4.2)mN/mm2，達(dá)到 50% 活性需要[Ca2+]i(Ca50)為(0.57±0.03)μmol/L。給予NCA后，心肌收縮力峰值增加[(124.0±15.0)mN/mm2，P ＜ 0.05 vs control]，達(dá)到 50% 活性需要[Ca2+]i明顯降低[(0.39±0.01)μmol/L;P ＜ 0.01 vs control]。給予NCA的心肌組織，其希爾系數(shù)沒(méi)有受到影響 (3.94±0.18 vs 4.92 ±0.84，P＞0.05)。由此可見(jiàn)，NCA/HNO可以增強(qiáng)最大鈣離子活化張力。給予NCA后，不同細(xì)胞外鈣濃度 (0.01 －100 μmol/L)去肌膜心肌組織心肌收縮力峰值增加，Ca50降低[NCA － group，Ca50=0.3 μmol/L，P ＜ 0.01 vs control(1.35 μmol/L);Fmax=(90.1 ± 1.6)mN/mm2，P ＜0.05 vs control[(85.2 ± 1.2)mN/mm2]，見(jiàn)圖3。

3 NCA誘導(dǎo)下張力發(fā)展對(duì)細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量的敏感性

Figure 3.Steady－state force－Ca2+relations in intact(A)and skinned(B)muscles.±s.n=9(A)or n=6(B).*P ＜0.05 vs control.圖3 NCA增加心肌纖維對(duì)Ca2+反應(yīng)性

DTT對(duì)于基本的收縮力無(wú)效;然而，它能阻斷NCA(20 μmol/L)誘導(dǎo)的Ca2+敏感作用。DTT在5－10 min內(nèi)逆轉(zhuǎn)NCA增加收縮力作用，見(jiàn)圖4。在無(wú)DTT存在條件下，收縮力將保持其興奮性長(zhǎng)達(dá)20 min以上。由此可見(jiàn)，DTT可以阻止并逆轉(zhuǎn)NCA對(duì)收縮力的作用效果。

Figure 4.DTT(5 mmol/L)not only prevented but also reversed the effect of NCA on force development.±s.n=6.*P＜ 0.05 vs NCA.圖4 DTT影響NCA增加收縮力的作用

4 NCA增加心肌收縮力通過(guò)肌原纖維蛋白質(zhì)巰基翻譯后修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)

非還原條件下 (無(wú)DTT)NCA/HNO使肌原纖維(如Tm)分子發(fā)生交聯(lián)，而還原條件則交聯(lián)條帶消失，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Western blotting of cardiac non－ reducing(A)and reducing(B)tropomyosin(39 kD).A cross－ linking band(78 kD)in tropomyosin was seen under non－ reducing condition.There was no change in reducing tropomysim.M:marker.10 μg，20 μg and 30 μg:the total protein loading quantity.圖5 NCA在還原條件下對(duì)Tm的翻譯后修飾作用

討 論

本實(shí)驗(yàn)首次研究了NCA提供的HNO在分離、完整的心肌組織上產(chǎn)生一種直接劑量依賴(lài)性的正性變力作用。該作用不僅包括增加了心肌收縮力和[Ca2+]i瞬時(shí)電流峰值，而且由于最大[Ca2+]i升高活化了張力，使得這些變化在敏感性上的增長(zhǎng)是不對(duì)稱(chēng)的。此反應(yīng)與NO作用效果不同，可被還原劑DTT所阻斷，同時(shí)具備較強(qiáng)的氧化還原反應(yīng)敏感性。

NO與HNO僅相差1個(gè)電子。然而，HNO被認(rèn)為能應(yīng)用巰基化合物和高鐵蛋白進(jìn)行加成反應(yīng)[12]而NO則不能。NO的靶點(diǎn)首先是非氧合細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)可溶解性二價(jià)鐵鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，而HNO生物活性的主要靶點(diǎn)則是巰基蛋白質(zhì)或巰基肽[1]。盡管NO cGMP非依賴(lài)性收縮效應(yīng)已經(jīng)被證實(shí)，但大部分NO對(duì)心臟的作用仍與cGMP/PKG激活作用相關(guān)。一項(xiàng)重要的證據(jù)支持cGMP/PKG的激活是NO(及其被氧化的同源物質(zhì))對(duì)心臟進(jìn)行調(diào)節(jié)的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，借此減低了肌原纖維對(duì)Ca2+脫敏后的收縮性[7]。這樣的脫敏作用被認(rèn)為對(duì)加速心肌舒張具有重要意義。該作用可因PKG藥物阻斷或遺傳缺失，或心肌鈣蛋白I在Ser23/24位點(diǎn)磷酸化[13]而被抑制?；钚缘?lèi)物質(zhì)過(guò)亞硝酸鹽也能降低肌原纖維對(duì)鈣離子的反應(yīng)性，導(dǎo)致心臟抑制效應(yīng)，部分效應(yīng)是由 PKG介導(dǎo)的[8]。

由NCA提供的HNO反應(yīng)則完全不同，這可能由于其與鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶或作為收縮機(jī)制的主要靶點(diǎn)半胱氨酸殘基相互作用。研究表明HNO對(duì)選取的硫醇鹽(－S·)發(fā)生反應(yīng)，對(duì)巰基化合物亞群(－SH)也有高反應(yīng)性[1]，這些反應(yīng)都證實(shí)了HNO具有選擇性和作用可逆性。目前和以往資料表明，收縮作用可迅速用DTT逆轉(zhuǎn)。在分離的家兔心臟肌漿網(wǎng)囊泡[5]或大鼠心肌細(xì)胞上[8]研究發(fā)現(xiàn)HNO誘導(dǎo)的肌漿網(wǎng)鈣離子的釋放也可被DTT完全逆轉(zhuǎn)。最近在酵母的一項(xiàng)研究中也顯示了HNO選擇性，不改變細(xì)胞內(nèi)巰基化合物前提下，HNO在其活化位點(diǎn)硫醇鹽殘基內(nèi)具有特異性的靶點(diǎn)磷酸甘油醛脫氫酶[14]。我們假設(shè)NCA/HNO可以在肌原纖維和/或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)的半胱氨酸“靶點(diǎn)”上誘發(fā)相似的具有選擇性的化學(xué)修飾，Western blotting證實(shí)NCA在非還原條件下使肌原纖維的Tm分子發(fā)生交聯(lián)，該作用可能促進(jìn)橫橋轉(zhuǎn)換率發(fā)生變化，進(jìn)而增加收縮張力的產(chǎn)生。進(jìn)一步的研究旨在明確這些變化的分子性質(zhì)和位點(diǎn)。

HNO增加最大Ca2+活化張力機(jī)制至今尚不清楚。然而，研究表明僅最大Ca2+活化張力的增加即可導(dǎo)致橫橋的變化。張力發(fā)展依賴(lài)于相關(guān)橫橋的數(shù)目及其動(dòng)力學(xué)特征。橫橋轉(zhuǎn)換率能明顯影響張力 －pCa之間的相互關(guān)系，從而增加與Ca2+活化張力相關(guān)性的比率。HNO誘導(dǎo)的橫橋循環(huán)性的改變是引起改變收縮性的唯一途徑，這與在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)進(jìn)行變化來(lái)調(diào)節(jié)收縮性的機(jī)制密切相關(guān)。

我們的研究也證實(shí)了在完整心肌組織內(nèi)[Ca2+]i增加是由NCA誘導(dǎo)的。盡管[Ca2+]i的增加與肌原纖維致敏作用的相關(guān)性已經(jīng)被證實(shí)，但這種增加可能是在較高NCA劑量條件下成為增強(qiáng)心肌收縮力的基礎(chǔ)。在分離的小鼠肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，HNO可以增加鈣離子的吸收及其從肌漿網(wǎng)的釋放，適當(dāng)增加瞬時(shí)電流而不出現(xiàn)舒張期鈣離子的逆轉(zhuǎn)[6]。這可以對(duì)目前研究中所觀察的[Ca2+]i的變化進(jìn)行解釋。這些機(jī)制與致敏效應(yīng)一起表明HNO對(duì)心臟肌原纖維及肌漿網(wǎng)具有新奇的效應(yīng)，可以在缺乏能量供應(yīng)的條件下增加心肌潛在的收縮能力。

總言之，NCA提供的HNO能增強(qiáng)大鼠心肌組織收縮力和細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變，且前者變化幅度大于后者，這種作用部分由于肌原纖維對(duì)鈣離子敏感性的增加所致。該作用對(duì)于還原性環(huán)境較敏感。該作用的主要分子靶點(diǎn)可能是Tm半胱氨酸的巰基蛋白質(zhì)。進(jìn)一步研究需要證實(shí)NCA對(duì)心力衰竭動(dòng)物模型心肌收縮力的作用效果，為實(shí)現(xiàn)NCA/HNO的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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