周 熹 邱貴興 吳志宏 原所茂 費 琦 劉 正

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730)

青少年特發(fā)性脊柱側凸 (adolescent idiopathic scoliosis，AIS)的發(fā)病原因及具體機制尚不清楚，多數(shù)學者認為其可能是多基因遺傳病[1-5]。有文獻報道鈣調蛋白水平增高和進展性AIS之間有一定關聯(lián)意義[6-12]，也有研究顯示鈣調蛋白 1基因(CALM1基因)的多態(tài)性與AIS不同亞型有一定聯(lián)系[13]。與 CALM1基因一樣，鈣調蛋白 2基因(CALM2基因)同樣參與鈣調蛋白合成表達，本研究選擇CALM2基因為考察對象，研究其多態(tài)性與AIS的遺傳易感性之間的關系，并且對不同基因表型對AIS臨床亞型之間的關聯(lián)性進行了分析探討。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用“病例-對照”研究方法，研究對象為中國漢族人群，包括散發(fā)性青少年特發(fā)性脊柱側凸病例組和正常對照組。病例組來自2005年10月至2008年2月北京協(xié)和醫(yī)院脊柱外科病房住院的中國漢族AIS患者 (Cobb角≥30°)，男17例，女90例，年齡范圍10～22歲，平均15.53±2.18歲。所有患者通過臨床和影像學確診，排除其它類型的脊柱側凸。分別記錄所有患者PUMC分型[14]資料、側凸頂點位置以及Cobb角。對照組來自同期北京協(xié)和醫(yī)院就診的外傷、感染患者及健康查體者，排除脊柱側凸家族史和病史。對照組男17例，女90例，年齡范圍10～20歲，平均15.12±2.59歲。所有研究對象和其家長簽署知情同意書，并獲得中國協(xié)和醫(yī)科大學臨床研究倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 SNP(single nucleotide polymorphyism，單核苷酸多態(tài)性)位點選擇 在美國NCBI-SNPs數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)和歐洲Ensembl-SNPs數(shù)據(jù)庫 (http://www.ensembl.org/index.html)中，查找 CALM2基因的已知SNPs。根據(jù)國際人類基因組單體型圖計劃 (http://www.Hapmap.org)提供的基因型數(shù)據(jù)，優(yōu)先選取雜合度高于10%，位于外顯子區(qū)域或有錯義突變的SNPs和位于3'-、5'-調控區(qū)的SNPs作為遺傳標記，共選取8個SNPs，具體見表1。

表1 篩查的SNPs

1.2.2 提取DNA 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)，根據(jù)它的Spin柱方案從外周全血中進行DNA的提取，并用分光光度法對其濃度進行測定，最終提取DNA濃度約為25 ng/Ixl。

1.2.3 DNA濃度測定和濃縮純化 VeraCode GoldenGate Genotyping Assay檢測SNPs所需的最佳濃度為50～100 ng/μl，較提取濃度高，因此采用離心重溶解的方式進行濃縮純化，達到要求濃度。

1.2.4 SNPs檢測 采用的VeraCode GoldenGate Genotyping Assay:96＆384-plex系統(tǒng) (Illumina公司)進行SNPs檢測。該系統(tǒng)采用光纖微珠芯片平臺進行基因分型，得到SNP位點信息。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

應用SNPstats軟件 (Availability:http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)[15]、 SAS 8.2 軟 件、Haploview 4.0(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)等統(tǒng)計學軟件，進行基因型頻率分布的Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗，單位點和基因型統(tǒng)計分析。并結合基因-AIS臨床表型進行關聯(lián)分析。

2 結果

2.1 流行病學資料統(tǒng)計處理

通過卡方檢驗 (χ2檢驗，SPSS13.0)證實病例組和對照組的年齡 (P=0.306)和性別 (P=1.000)的構成比無統(tǒng)計學差異。

按PUMC分型將病例組107例患者分為Ⅰ組(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ組 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ組 (PUMCⅢ型)9例。按照側凸頂點位于T2～T11、12椎間隙為胸彎;側凸頂點位于T12～L1為胸腰彎;側凸頂點位于L1、2椎間隙～L4、5椎間隙為腰彎。107例AIS組患者按照側主彎凸頂點位置分為胸彎組66例，胸腰彎組10例，腰彎組31例。

2.2 Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗

Hardy-Weinberg平衡檢驗結果如表2所示，病例組和對照組中檢測的各種基因型頻數(shù)均符合H-W平衡，說明樣本選擇在人群中具有代表性。

表2 基因型Hardy-Weinberg平衡的擬合優(yōu)度χ2 檢驗

2.3 基于等位基因的“病例-對照”關聯(lián)分析

從表3中可以看出，陽性 (P＜0.05)位點位于編號SNP3的rs10153674(P=0.003)。具體分析可以得出，rs10153674(SNP3)等位基因 G，與AIS的易感性升高相關。

2.4 基于基因型的“病例-對照”關聯(lián)分析

從表4中可以看出，陽性 (P＜0.05)位點位于編號SNP3的rs10153674(P=0.003)。具體分析可以得出，rs10153674(SNP3)等位基因型G/G，與AIS的易感性升高相關。

在表3和表4的基礎上，對病例-對照組中基因頻率或基因型有統(tǒng)計學差異的位點，利用在線的SNPstats軟件，進行非條件Logistic回歸模型分析。軟件根據(jù)五種遺傳學模型 (Codominant、Dominant、Recessive、Overdominant和Log-additive)的特點進行Logistic回歸分析。結果見表5，AIC和BIC值越小說明模型越精確。因此rs10153674(SNP3)位點可能以Dominant遺傳模型的方式與AIS的發(fā)生相關聯(lián)。

2.5 基因型多態(tài)性與PUMC分型的關聯(lián)分析

按PUMC分型將病例組107例患者分為Ⅰ組(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ組 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ組 (PUMCⅢ型)9例。分別進行三組與對照組以及三組間SNP位點等位基因多態(tài)性分布頻率比較。由表6結果可見，CALM2基因rs10153674和rs1027478位點在PUMC I型和對照組中的分布頻率統(tǒng)計學上存在顯著差異 (P=0.038和P=0.006)，進一步分析得知 rs10153674基因型 G/G、rs1027478基因型A/G與PUMC I型的發(fā)生有關。

表3 病例組和對照組SNP位點等位基因頻率的關聯(lián)分析結果

表6 PUMCⅠ型組與對照組SNPs基因型多態(tài)性分析

3 討論

青少年特發(fā)性脊柱側凸的具體發(fā)病原因目前尚不確定，但隨著分子生物學研究的進展，更多的學者傾向于認為該病是個多基因相關的遺傳疾病，其具體遺傳模式仍未確定。

早在1979年，Yarom等[6]發(fā)現(xiàn)AIS患者椎旁肌細胞內Ca2+濃度上升，同時出現(xiàn)肌球蛋白的變性，與肌球蛋白異常相應的血小板中Ca2+濃度亦上升，導致Ca2+內穩(wěn)態(tài)失衡。他們認為AIS患者可能存在廣泛的細胞膜受損，因而出現(xiàn)椎旁肌以外的肌肉出現(xiàn)肌細胞內Ca2+濃度顯著升高。Machida等[7]認為這種細胞膜的缺損會引起脊柱生長失調，從而導致脊柱側凸的發(fā)生。Cohen等[8]報道AIS患者血小板CaM含量是正常人群的2.5～3倍，并與脊柱側凸嚴重程度呈正相關。Kindsfate[9]和 Lowe[10]等研究發(fā)現(xiàn)進展性脊柱側凸患者 (＞10度/年)與穩(wěn)定性脊柱側凸患者 (＜10度/年=相比，其血小板中CaM含量明顯增高。國內，邱貴興等[11，12]的系列研究發(fā)現(xiàn)AIS患者椎旁肌組織、關節(jié)突骨組織中鈣調蛋白表達升高。

Benitez等[16]發(fā)現(xiàn)褪黑素的生理功能與鈣調蛋白密切相關，并提出褪黑素和鈣調蛋白相互作用學說，認為褪黑素與CaM動態(tài)結合后即被激活。褪黑素和CaM的結合具有強親和性、可飽和性、可逆性、Ca2依賴性和配體選擇性，結合以后的CaM幾乎所有結構域都與褪黑素結合，故不會二級結構的改變。

總之，CaM與AIS關系密切，但其作用機制尚不明確。因此我們考慮，鈣調蛋白的編碼基因很可能是參與AIS發(fā)病的多個相關基因中的一個。邱貴興等[13]的系列研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CALM1基因的多態(tài)性可能和特發(fā)性脊柱側凸小同臨床亞型相關聯(lián)。本研究采用了全新的微珠芯片技術 (BeadArray)SNP檢測方法，對CALM2基因的SNPs進行了檢測，并取得了陽性發(fā)現(xiàn)。

SNPs分為兩種:一種是位于基因編碼區(qū)內(Coding region)的SNP，稱為cSNP.cSNP又分為同義SNP(Synonymous SNP)和錯義SNP(Missense SNP)兩種。前者所致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，而后者堿基序列的改變可使翻譯后的氨基酸序列發(fā)生改變，從而可能影響蛋白質的功能。另一種是位于基因組非編碼區(qū)的SNP。這些SNP分布于內含子、5'-非翻譯區(qū)(Untransltion region，UTR)，3'-UTR及其它區(qū)域。位于5'-UTR區(qū)域的SNP可能參與調控基因的轉錄和翻譯過程，位于3'-UTR區(qū)域的SNP可能影響mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過程，位于內含子的SNP可能影響mRNA前體的剪接。這些位于編碼區(qū)和調控序列中的SNP可能引起蛋白質表達的質或量的變化，可能與致病相關，常被稱為“功能多態(tài)性”(Functionalpolymorphism)[17]。 rs10153674 位 于CALM2基因的內含子1區(qū)，rs1027478位于內含子2區(qū)。目前尚沒有文獻對這兩個SNPs位點的具體功能進行研究。

一般存在遺傳標記位點和疾病關聯(lián)的現(xiàn)象可歸納為兩種情況:一種是遺傳標記本身與疾病的病理發(fā)生有關;另一種是致病位點與遺傳標記位點存在很強的連鎖不平衡[18]。由此，我們推測這三個SNPs位點可能與疾病的病理發(fā)生無關，而是與某一致病基因位點存在很強的連鎖不平衡。我們推測這三個位點堿基的改變可能影響CALM2基因轉錄翻譯到CaM過程中的mRNA前體的剪切，使CaM的表達量上升，進而導致脊柱側凸的發(fā)生。

AIS臨床表現(xiàn)復雜，且其作為一種多因素影響疾病，不同的主效、微效基因可能決定不同的臨床特征，所以結合AIS臨床表型特征進一步分析。按照PUMC分型理論[14]，AIS根據(jù)側凸的數(shù)量分為單彎、雙彎、三彎，分別為PUMCⅠ、Ⅱ、Ⅲ型。按照現(xiàn)有觀點認為AIS是多基因和環(huán)境因素共同作用的結果，但究竟遺傳學因素對于雙彎或三彎的發(fā)生起到何種作用，是直接激發(fā)雙彎或三彎，還是直接激發(fā)單發(fā)，然后在環(huán)境因素的作用下繼發(fā)次彎，還是這二者兼而有之，這是目前困擾我們的難題，也正是我們按照不同臨床分析進行遺傳學病因機制研究的目的。本組研究中證實PUMC I型AIS可能與CALM2基因rs10153674和rs1027478位點基因型多態(tài)性有關。我們據(jù)此推測:AIS不同的臨床表型可能和不同的SNP位點多態(tài)性有關，而AIS的PUMC分型可能和不同的SNP位點多態(tài)性有關，提示PUMC分型不僅是指導臨床治療的可靠標準，而且可能是符合遺傳病因學機制的合理分型，但這需要擴大樣本量、全面分析候選基因SNPs位點后進一步研究證實。

AIS作為多基因遺傳疾病，一個或多個基因導致不同的表型，任何一個基因均可能使患者處于易感狀態(tài)，年齡、性別、環(huán)境因素的影響使基因表型趨于復雜化，只有證實控制多樣表型基因范圍的存在，才能進一步確定畸形相關基因。從基因水平探索引起AIS的病因是一個有意義的方向，合理應用連鎖分析的研究成果，選擇大量無親緣關系的散發(fā)個體進行關聯(lián)分析，有助于發(fā)現(xiàn)易感基因的精確位點。從基因水平上研究AIS的病因，探索和發(fā)現(xiàn)人類AIS的易感基因并進一步通過前瞻性隊列研究實驗來證實，設計出用于診斷的基因芯片或標記物，有助于提高孕期早期診斷AIS的水平，為優(yōu)生優(yōu)育作貢獻。

[1]Wynne R.A genetic survey of idiopathic scoliosis in Boston，Massachusetts.J Bone Joint Surg Am，1973，55:974-982.

[2]Machida M.Cause of idiopathic scoliosis.Spine，1999，24(24):2576-2583.

[3]Damborg F，Engell V.The Genetics of AIS:A Twin Study.Proceedings of the 39th Annal SRS＆ Course，California.2004.

[4]Ogilvie JW，Braun J，Argyle V，et al.The search for idiopathic scoliosis genes.Spine，2006，31(6):679-681.

[5]Cowell HR，Hall JN，MacEwen GD.Genetic aspects of idiopathic scoliosis.Clin Orthop，1972，86:121-131.

[6]Yarom R，Robin GC.Studies on spinal and peripheral muscles from patients with scoliosis.Spine，1979，4(1):12-21.

[7]Machida M，Dubousset J，Imamura Y，et al.An experimental study in chickens for the pathogenesis of idiopathic scoliosis.Spine，1993，18(12):1609-1615.

[8]Cohen DS，Solomons CS，Lowe TG.Altered platelet calmodulin activity in idiopathic scoliosis.Orthop Trans，1985，9:106.

[9]Kindsfater K，Lowe T，Lawellin D，et al.Levels of platelet calmodulin for the prediction of progression and severity of adolescent idiopathic scoliosis. JBone JointSurg Am，1994，76 (8):1186-1192.

[10]Lowe T，Lawellin D，Smith D，et al.Platelet calmodulin levels in adolescent idiopathic scoliosis:do the levels correlate with curve progression and severity?Spine，2002，27(7):768-775.

[11]趙宇，邱貴興.特發(fā)性脊柱側凸椎旁肌組織鈣調蛋白和神經(jīng)元型一氧化氮合酶表達的研究.中華醫(yī)學雜志，2004，84(16):1358-1360.

[12]邱貴興，李婧，劉勇，等.鈣調蛋白在青少年特發(fā)性脊柱側凸患者關節(jié)突組織中的表達.中華醫(yī)學雜志，2006，86(29):2017-2019.

[13]趙棟，邱貴興，王以朋，等.鈣調蛋白1基因多態(tài)性和青少年特發(fā)性脊柱側凸不同亞型的關系.中華骨科雜志，2008，28(6):475-479.

[14]邱貴興，仉建國，王以朋，等.特發(fā)性脊柱側凸的PUMC(協(xié)和)分型系統(tǒng).中華骨科雜志，2003，23(1):1-9.

[15]Sole X，Guino E，Valls J，et a1.SNPStats:a web tool for the analysis of association studies.Bioinformatics，2006，22(15):1928-1929.

[16]Benítez KG，Ríos A，Martínez A，et al.In vitro inhibition of Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡactivity by melatonin.Biochim Biophys Acta，1996，1290(2):191-196.

[17]Daly MJ，Rioux JD，Schaffner SF，et al.High-resolution haplotype structure in the human genome.Nat Genet，2001，29(2):229-232.

[18]Yahata T，Quan J，Tamura N，et al.Association between single nucleotide polymorphisms of estrogen receptor:gene and efficacy of HRT on bone mineral density in post-menopausal Japanese women.Hum Reprod，2005，20(7):1860-1866.