魏 捷，蔣 華

器官培養(yǎng)保存法是目前國際上主要的角膜供體長期保存法，能保持角膜內(nèi)皮細(xì)胞（corneal endothelial cells，CEC）活性長達(dá) 4周，不僅利于合理配置角膜資源，而且角膜抗原性也會隨保存時間延長而逐漸減弱。研究認(rèn)為，保存至3周時角膜片內(nèi)的樹突狀細(xì)胞可完全消失[1]，可以降低免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）因?yàn)闋I養(yǎng)成分豐富在器官培養(yǎng)保存法中應(yīng)用廣泛，但其批間變異大，成分不夠清晰穩(wěn)定，還有病原體污染風(fēng)險(xiǎn)。出于對人體安全性的長遠(yuǎn)考慮，有必要考慮自培養(yǎng)基中去除血清成分[2]。本實(shí)驗(yàn)擬對新型培養(yǎng)基－無動物成分培養(yǎng)基 （animal compound free medium，ACF）在無血清器官培養(yǎng)保存CEC活性方面的效果進(jìn)行初步探索。

1 材料和方法

1.1 材料與動物分組 16只SPF級成年Wistar大鼠，體重200～250 g，雌雄不限，山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，過量麻醉處死，取雙側(cè)眼球。ACF購自美國Sciencell公司，MEM購自美國Gibco公司，葡聚糖T-500購自美國Pharmacia公司，兔多克隆抗ZO-1抗體購自Santa Cruz公司，SP-9000免疫組化染色試劑盒來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，RNA裂解液、總RNA提取試劑盒購自上海華美生物工程公司，TaKaRa試劑盒及DNA Marker由大連寶生物公司提供，引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。將角膜片隨機(jī)分為2組，每組16只。對照組：角膜保存于MEM+2%FBS培養(yǎng)液中。試驗(yàn)組：即ACF組，角膜保存于無血清的ACF培養(yǎng)液中。

1.2 角膜器官培養(yǎng)保存方法 在超凈臺上按眼庫標(biāo)準(zhǔn)無菌化程序處理。生理鹽水沖洗眼球，再依序浸泡于0.5%碘伏溶液和含500 U/ml慶大霉素的乳酸林格液中，時間分別為2、20 min。剪下完整角膜片，角鞏膜緣縫合1針后懸吊于20 ml培養(yǎng)液中，密封保存瓶口，置于31℃恒溫箱中不換液保存4周。保存結(jié)束后，將角膜移至10 ml脫水液（各組培養(yǎng)液中加5%葡聚糖T500）中，31℃恒溫脫水48 h。

1.3 保存前后ECD計(jì)數(shù) 保存前大鼠角膜置于培養(yǎng)皿中，0.9%生理鹽水浸泡4 min，使細(xì)胞間隙暫時擴(kuò)大，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度（endothelial cells density，ECD）。 保存結(jié)束脫水后，大鼠角膜內(nèi)皮面滴0.25%臺盼藍(lán)染色1 min，生理鹽水緩慢漂洗，再滴1%茜素紅染色2 min，生理鹽水漂洗，普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)角膜ECD。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測內(nèi)皮層中ZO-1的表達(dá) 保存結(jié)束取出大鼠角膜，立即OCT包埋，液氮內(nèi)速凍15 min，轉(zhuǎn)入深低溫冰箱保存?zhèn)溆谩z測時連續(xù)冰凍切片，厚度4 μm，常規(guī)貼片、固定，晾干，密封，4℃短期保存。染色當(dāng)天取出玻片，按說明書行SP三步法免疫組織化學(xué)染色，風(fēng)干，封片，觀察照相。兔多克隆抗ZO-1抗體按1∶200濃度稀釋。

1.5 RT-PCR檢測去上皮角膜中ZO-1mRNA表達(dá)每組取6只保存后大鼠角膜，去除上皮層，按照TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。ZO-1(249bP)的上游引物：5’-GCCTCTGCAGTTAAGCAT-3’，下游引物：5’-AAGAGCTGGCTGTTTTAA-3’。 β-actin(281bP)的上游引物：5'-TGACGAGGCCCAGAGCAAGA-3'，下游引物：5'-ATGGGCACAGTGTGGGTGAC-3'。 PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，反應(yīng)35個循環(huán)，其中94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳100 min，凝膠紫外成像系統(tǒng)中掃描拍照并分析，

以目的基因的擴(kuò)增帶灰度與同管擴(kuò)增的β-actin擴(kuò)增帶灰度之比來表示目的基因的mRNA表達(dá)水平。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)先求出組內(nèi)x±s，顯著性分析用t檢驗(yàn)。

表1 保存前后各組大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度（個/mm2，x±s)

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)保存過程中角膜的大體圖像 自培養(yǎng)后第2天，兩組角膜出現(xiàn)漸進(jìn)性加重的基質(zhì)水腫，上皮灰白色混濁，中央出現(xiàn)片狀剝離。此后，角膜水腫逐漸加重，基質(zhì)明顯增厚，內(nèi)皮面出現(xiàn)皺褶并逐漸增多。多數(shù)角膜在保存7～10 d時厚度達(dá)峰值。在葡聚糖T500中脫水48 h后，角膜變薄并基本恢復(fù)透明。

2.2 保存前后CEC計(jì)數(shù) 保存前兩組間角膜ECD無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。保存結(jié)束并脫水2 d后，對照組ECD大幅下降，而ACF組的ECD則高于2000個/mm2，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。計(jì)算 28 d保存期內(nèi)日均CEC丟失率 [(保存前ECD－保存后ECD)／保存前ECD×100%÷28]衡量CEC損失程度，發(fā)現(xiàn)ACF組明顯低于對照組，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。脫水結(jié)束后，活性染色顯示ACF組中CEC死亡比例明顯低于對照組，組間比較差異非常顯著（P＜0.01）。 見表 1。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 冰凍切片顯示ZO-1在大鼠角膜內(nèi)皮面有明確表達(dá)，呈棕黃色顆粒，廣泛分布于胞漿內(nèi)（圖1）。ACF組切片上CEC與后彈力層貼附較緊密，ZO-1即隨內(nèi)皮細(xì)胞呈連續(xù)線形表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度高；對照組CEC間連接相對松散，有部分細(xì)胞脫落或不表達(dá)，ZO-1表達(dá)強(qiáng)度相對降低。

①對照（MEM+20 ml/L FBS)組 ②ACF 組圖 1 保存后大鼠角膜內(nèi)皮層中ZO-1的表達(dá)（SABC ×400）

2.4 RT-PCR半定量檢測去上皮大鼠角膜中ZO-1mRNA的表達(dá) 結(jié)果顯示兩組大鼠角膜都有ZO-1mRNA表達(dá)，大小249 bp，與目的基因長度一致（圖 2）。ACF組 ZO-1mRNA表達(dá)水平 （0.921 8±0.027 0）明顯高于對照組（0.452 7±0.012 7），組間比較有非常顯著性差異（t=38.448，P=0.000）。

圖 2 RT-PCR檢測去上皮大鼠角膜中ZO-1mRNA表達(dá)的電泳圖

3 討論

要實(shí)現(xiàn)角膜植片無血清器官培養(yǎng)方式，前提是尋找到營養(yǎng)成分更為豐富的替代培養(yǎng)基。近年來，一些特殊設(shè)計(jì)無血清培養(yǎng)基相繼問世，而被稱作“chemical defined”（CD，限定化學(xué)成分的）的無動物來源培養(yǎng)基的出現(xiàn)，標(biāo)志著細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展的更高境界，徹底消除了培養(yǎng)基生物安全方面的擔(dān)憂。目前國外學(xué)者在該領(lǐng)域的研究結(jié)論多傾向于選擇endothelial SFM[3，4]，一種原設(shè)計(jì)支持人臍靜脈和臍動脈內(nèi)皮細(xì)胞分離、生長的特殊培養(yǎng)基。它對CEC的保存效果確切，但價格昂貴，不是推廣應(yīng)用的最佳選擇。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇研究成本相對較低的ACF。

Slettedal等[4]研究證實(shí)，即使在人角膜，在器官保存損傷過程中，CEC也會啟動修復(fù)程序，具體修復(fù)機(jī)制不僅有擴(kuò)大移行，還包括增殖分裂過程。而ACF中富含多種對于啟動和促進(jìn)CEC的增殖修復(fù)都非常關(guān)鍵的生長因子和種類豐富的其他營養(yǎng)成分，可以更好地發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保存結(jié)束后，MEM＋2%FBS組的ECD值降至2000個/mm2以下，證明這種“基礎(chǔ)”培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不足以充分滿足不換液狀態(tài)下CEC的長期生存需要。相比之下，無血清的ACF組不僅最終ECD值要高出許多，達(dá)到（2 143±169）個/mm2，還同時擁有較低的細(xì)胞日均損失率和死亡細(xì)胞比例。在眼庫工作中，角膜ECD值是評價保存后植片質(zhì)量的最重要指標(biāo)，多要求在2 000～2 200個/mm2以上，ACF組的保存結(jié)果完全滿足該項(xiàng)要求，進(jìn)一步證明無血清ACF可以較傳統(tǒng)MEM培養(yǎng)基更好地保存CEC活性，滿足移植手術(shù)的需要。

細(xì)胞間緊密連接在維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能上發(fā)揮著重要作用[6]。ZO-1是一種磷酸蛋白，蛋白家族膜相關(guān)鳥苷酸激酶的家族成員，分子量220 000，屬結(jié)構(gòu)性跨膜蛋白，是構(gòu)成上皮和內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的重要成分之一，到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)缺乏ZO-1的緊密連接。若是ZO-1表達(dá)水平下降或缺失，多數(shù)情況下存在緊密連接的組織結(jié)構(gòu)如血腦屏障、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間、角膜內(nèi)皮細(xì)胞間等會隨之松散甚至分解，所以ZO-1常被用作緊密連接的屏障功能和通透性功能的衡量指標(biāo)[7，8]。現(xiàn)有ZO-1抗體只可用于人或鼠，因此，筆者選用大鼠角膜來做檢測。病理切片發(fā)現(xiàn)ZO-1的確存在于保存后大鼠CEC層。不過大鼠角膜小且后彈力層菲薄撕除難度大，而ZO-1在基質(zhì)中又少有表達(dá)，所以半定量RT-PCR法改為檢測去上皮后大鼠角膜中ZO-1的表達(dá)，結(jié)果與CEC的計(jì)數(shù)資料趨勢保持一致，ZO-1在ACF保存組的表達(dá)水平明顯高于MEM組，檢測ZO-1的表達(dá)可在一定程度上輔助反映CEC的功能狀態(tài)和細(xì)胞間緊密連接的完整性，也從另一個側(cè)面證實(shí)了ACF能有效保持CEC活性的良好效果。

綜上所述，自器官培養(yǎng)基中除去血清成分是組織細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展過程中的新要求和必然趨勢。ACF營養(yǎng)豐富，能有效降低密閉保存過程中CEC的損失程度，成分明確，便于進(jìn)行對比研究，還可以排除病原體傳染風(fēng)險(xiǎn)，對CEC的保護(hù)作用明顯超越傳統(tǒng)的MEM，在無血清器官培養(yǎng)保存CEC活性方面極有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

[1]劉 濤，潘志強(qiáng)，王 立，等.兔角膜器官培養(yǎng)保存與應(yīng)用的研究[J].中華眼科雜志，2006，42(9):808-813.

[2]Hempel B，Bednarz J，Engelmann K.Use of a serum-free medium for long-term storage of human corneas.Influence on endothelial cell density and corneal metabolism[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2001，239(10):801-805.

[3]Bednarz J，Doubilei V，Wollnik PC，et al.Effect of three different media on serum free culture of donor corneas and isolated human corneal endothelial cells[J].Br J Ophthalmol，2001，85(12):1416-1420.

[4]Slettedal JK，Lyberg T，Rger M，et al.Regeneration with proliferation of the endothelium of cultured human donor corneas with extended postmortem time[J].Cornea，2008，27(2):212-219.

[5]邵應(yīng)峰，胡誕寧，陳家祺.bFGF、EGF和NGF對人角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究[J].眼科學(xué)報(bào)，2008，24(1):9-12.

[6]Proulx S，Bensaoula T，Nada O，et al.Transplantation of a tissueengineered corneal endothelium reconstructed on a devitalized carrier in the feline model[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50(6):2686-2694.

[7]張文一，白海青，士崢華.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、精氨酸代謝相關(guān)酶的表達(dá)及一氧化氮對細(xì)胞緊密連接的影響[J].中華眼底病雜志，2005，21(1):32-36.

[8]Hitani K，Yokoo S，Honda N，et al.Transplantation of a sheet of human corneal endothelial cell in a rabbit model[J].Mol Vis，2008，14(3):1-9.