李 勇，高 洪，嚴玉霖，楊桂梅，彭 潔，孔令青，劉海峰

(1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南昆明650201；2.云南省藥物研究所GLP中心，云南昆明650111；3.昆明醫(yī)學院，云南昆明650031；4.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，云南昆明650212)

內(nèi)毒素(Endotoxin，ET)是革蘭氏陰性細菌(Gram negative bacteria，GNB)細胞壁外膜的組成成分，其化學本質(zhì)為脂多糖(LPS)，它作為GNB的主要致病因子，在GNB感染中發(fā)揮著重要作用，常造成人畜ET血癥和ET休克，嚴重危害人畜健康。肝臟既是清除ET的場所，同時又是ET血癥、休克過程中最易受損的器官之一[1]。近年來研究表明，細胞凋亡與肝損傷有著密切的聯(lián)系，在許多肝臟疾病中均有細胞凋亡的發(fā)生，它往往通過直接或間接的途徑造成肝臟損傷。Fas/FasL系統(tǒng)是目前研究較為深入的一類與凋亡有關(guān)的基因系統(tǒng)，而由Fas基因表達的Fas蛋白是一種促凋亡蛋白[2-4]。大量研究表明，F(xiàn)as/FasL途徑是肝細胞的主要凋亡路徑[5-8]。而肝細胞凋亡是造成肝損傷的原因之一，Erwei等[9]利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，使Fas蛋白表達沉默，凋亡減少，保護肝細胞免受細胞毒性作用，從而避免肝臟受損。而ET能夠有效地促進肝細胞凋亡，從而造成肝損傷[10-11]。但在此過程中，ET對大鼠肝細胞Fas蛋白表達的影響尚未見報道。本實驗通過建立ET致大鼠肝臟損傷模型，應(yīng)用western blot和流式細胞術(shù)(FCM)，探討ET對大鼠肝細胞Fas蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、實驗動物與儀器 大腸桿菌O111∶B4內(nèi)毒素(L2630)購自美國Sigma公司；Fas兔多克隆 抗 體(BA0484)、HRP-羊 抗 兔 IgG(BA1054)、β-Actin鼠單克隆抗體(BM 0627)、HRP-羊抗鼠IgG(BA1050)均購自武漢博士德生物公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗兔IgG(ZF-0311)、濃縮型DAB試劑盒(ZLI9017)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；NC膜購自美國M illipore公司；SD大鼠由昆明醫(yī)學院實驗動物科提供；FACS Vantage SE流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品；超速冷凍離心機為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；DYCZ-24DN型垂直電泳槽和DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽均為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 動物分組、處理與樣品制備 48只實驗用SD大鼠，體質(zhì)量140g～160g，雌(無孕)雄不限。臨床檢查確認健康后，預(yù)飼養(yǎng)3d，自由飲水，隨機分為2組：第Ⅰ組為試驗組(n=24)，按5mg/kg劑量尾靜脈注射ET(1mg/m L)；第Ⅱ組為對照組(n=24)，按5m L/kg劑量尾靜脈注射無熱源生理鹽水；兩組大鼠分別于3h、4h、8h和12h各迫殺6只，采集肝臟。一部分用于Fas蛋白的western blot檢測；另一部分用于Fas蛋白的FCM檢測。

1.3 肝臟Fas蛋白的western blot檢測 組織經(jīng)研磨離心后，獲得蛋白樣品，取適量進行SDS-PAGE電泳，而后轉(zhuǎn)印至NC膜進行western blot檢測，一抗為Fas蛋白兔多克隆抗體(1∶300)，二抗為HRP-羊抗兔 IgG(1∶300)， DAB顯色，利用 Quantity one 4.6.2軟件掃描分析條帶灰度值，與內(nèi)參條帶灰度值之比作為結(jié)果。

1.4 肝臟Fas蛋白的FCM檢測 取適量肝臟組織于200目尼龍篩搓取，將濾液于2000r/min離心5min，清洗兩次；加入4%多聚甲醛，室溫固定15m in后1800r/min離心5min去上清，清洗；分別加入1∶100稀釋的Fas兔多克隆抗體和1∶50稀釋的FITC-羊抗兔IgG各避光37℃水浴孵育40m in，并清洗；最后加入冷PBS重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為 2×106/m L～5×106/m L。取 0.3m L細胞懸液于FACS Vantage SE流式細胞儀，采用Cell quest軟件獲取細胞并進行測定，以W inMDI2.9軟件分析并經(jīng)計算機處理得出蛋白的表達率。

1.5 統(tǒng)計與分析 各組數(shù)據(jù)以平均值(X)±標準差(SD)表示，組間差異采取顯著性t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 肝臟Fas蛋白的western blot檢測結(jié)果 肝臟Fas蛋白表達的western blot檢測結(jié)果顯示，試驗組Fas蛋白的表達隨時間的推移呈增加趨勢(圖1)，其灰度值明顯高于對照組(p<0.01)，并且始終呈上升趨勢(表 1)。

表1 肝臟Fas蛋白的表達結(jié)果(灰度值比)(n=6,X±SD)Table 1The expression results of Fas protein in liver(relative values of expression levels)(n=6,X±SD)

2.2 肝臟Fas蛋白的FCM檢測結(jié)果 檢測結(jié)果圖中橫坐標表示細胞大小，縱坐標表示熒光強度，根據(jù)強度大小自動換算為信道數(shù)值分別以線性和對數(shù)形式表示。根據(jù)默認值分為4個象限，其中B象限、D象限為細胞團塊或多細胞集聚體，C象限為細胞與熒光抗體的非特異結(jié)合，所以僅A象限數(shù)據(jù)為有效表達率。結(jié)果顯示，F(xiàn)as蛋白隨時間延長表達量增加(圖2)；表達率明顯高于對照組(p<0.01)，并且呈上升趨勢(表2)。

表2 肝臟Fas蛋白的表達結(jié)果(表達率，%)Table 2The expression results of Fas protein in liver(expression rates,%)(n=6,X±s)

3 討 論

ET在動物機體內(nèi)受血漿和細胞內(nèi)的多種內(nèi)源性物質(zhì)的調(diào)節(jié)。其中脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)與LPS刺激肝細胞和巨噬細胞的關(guān)系最為密切，LBP與LPS結(jié)合為可溶性LBP-LPS復合體，再與肝細胞表面的CD14受體結(jié)合并直接作用于肝細胞，從而誘導肝細胞Fas配體(FasL)等基因的表達[12]。

本研究采用western blot和FCM相結(jié)合的方法對ET致大鼠肝損傷中Fas蛋白表達的變化進行檢測，結(jié)果顯示：對照組和試驗組大鼠肝臟均有Fas蛋白的表達，對照組肝臟Fas蛋白表達均明顯低于試驗組，并且試驗組Fas蛋白表達隨著時間的延長而增加。Fas是一種促凋亡蛋白，F(xiàn)asL與Fas的結(jié)合導致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體的活化形式，隨后引起與之結(jié)合的Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)構(gòu)象發(fā)生改變，F(xiàn)ADD通過其死亡效應(yīng)功能區(qū)(DED)再與第3個N末端有該同源功能區(qū)稱為Fas激活的FADD樣白介素1-β轉(zhuǎn)化酶(ICE)結(jié)合導致后者的活化并被裂解，其裂解產(chǎn)物p10和p20亞基形成異聚體后即成為有活性的半胱氨酸蛋白酶，從而啟動ICE相關(guān)蛋白酶及caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導致細胞的凋亡[13-14]。本研究結(jié)果表明在ET作用下Fas蛋白表達隨時間推移而增加，而在Fas蛋白的促凋亡作用下，肝細胞的凋亡也隨時間的推移而加劇，在一定程度上造成肝臟的損傷?？梢奅T能夠誘導Fas蛋白表達的上調(diào)從而促進肝細胞凋亡，是ET致肝損傷的機制之一。

本研究中，試驗組Fas蛋白表達隨時間推移而逐漸增加，與對照組相比ET明顯表現(xiàn)出對Fas蛋白表達的促進作用，而Fas蛋白的促凋亡作用依賴于一系列的信號轉(zhuǎn)導；同樣在ET血癥及ET性休克過程中也伴隨著多條ET信號轉(zhuǎn)導途徑，它們彼此之間是否共同作用造成肝損傷？其共同作用的聯(lián)系如何？以及ET促進Fas蛋白表達更深層的機制又是什么？這些問題還有待于深入的研究和探討。

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