王善輝，池賢鳳，李 安，高三陽，李書光，王文秀，沈志強,*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院重點實驗室，山東濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600)

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽的一種急性、高度傳染性疫病，主要侵害雞和火雞，亦可感染其他禽類、鳥類及人類。NDV屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)，為單股負鏈RNA病毒，基因組全長15186bp，包括編碼6個蛋白的基因，即3'-NP-P-M-F-HN-L-5'[1-2]。禽類是NDV的自然宿主，但某些非禽類動物也顯示自然或?qū)嶒炐愿腥綨DV[3]。最近，Siba等研究顯示，NDV在牛體內(nèi)是高度減毒的，具有宿主限制性，并且能夠在其體內(nèi)誘導產(chǎn)生病毒特異性體液和黏膜免疫抗體反應[4]。

近年來，反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展使一些單股負鏈RNA病毒作為疫苗載體的研究成為熱點。其中，NDV為可攜帶外原基因的疫苗載體之一。最近，來自于NDV弱毒株LaSota[5-6]，中等毒力株Beaudette[7]和強毒株ZJ1[8]的全長感染性cDNA克隆的反向遺傳操作系統(tǒng)相繼構(gòu)建，這些系統(tǒng)不只可以研究NDV的發(fā)病機制和生物學，而且還可以將NDV用在禽類和非禽類物種的疫苗載體的研究中。NDV腦內(nèi)接種羊和豬可使其致死，而兩種動物均能抵抗大劑量靜脈注射NDV[9]。NDV經(jīng)鼻內(nèi)和氣管內(nèi)接種羊后，是否能夠?qū)崿F(xiàn)有限感染羊，并產(chǎn)生免疫反應，尚未見報道。因此，在本研究將NDV Clone-30弱毒疫苗株實驗性接種綿羊，并且檢測其對綿羊致病性和免疫反應，初步對NDV做為羊類傳染病疫苗載體的可行性進行研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細胞 NDV Clone-30疫苗株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；SPF雞種蛋購自濟南斯帕法斯家禽有限公司；雞胚成纖維細胞(CEF)由本實驗室制備。

1.2 實驗動物與分組 2周歲NDV HI抗體陰性的健康綿羊15只，隨機分為3組，每組5只綿羊。第一組為滴鼻接種組；第二組氣管灌注接種組；第三組為對照組。

1.3 免疫方法與安全試驗觀察 將血凝效價為210的NDV Clone-30株用PBS做5倍稀釋后，滴鼻接種組每只羊的每個鼻孔滴注2m L，即每只羊共接種4m L；氣管接種組的每只羊氣管灌注4m L；對照組1、2號羊，每個鼻孔滴注2m L PBS，3號、4號、5號羊氣管灌注4m L PBS。每天觀察接種羊的臨床癥狀，直至實驗結(jié)束。

1.4 接種動物排毒的檢測 于接種前和接種后1d至10d分別采集綿羊的鼻拭子和肛拭子。取鼻拭子和肛拭子的加抗生素浸液各100μL分別接種于10日齡SPF雞胚，并傳代兩次。收集接種96h的雞胚尿囊液，通過血凝試驗檢測病毒增殖情況。

1.5 RT-PCR檢測接種綿羊血液中NDV 于接種前和接種后1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d分別采集綿羊的抗凝血。采用TRIpure法分別提取RNA，以NDV F基因特異性引物，即上游引物P1：5'-AGGGATTGTGGTAACAGGAGA-3'，外下游引物P2：5'-GTCACAGACTCTTGTATCCTA-3'，內(nèi)下游引物 P3：5'-TACGGATAGAATCACCAAGGG-3'，通過RT-PCR檢測血液中是否存在NDV RNA。

1.6 敏感性試驗 將10-6TCID50的NDV尿囊液提取的RNA經(jīng)濃度測定后10-1～10-610倍系列稀釋，作為模板進行RT-PCR反應，以檢測其敏感性。

1.7 接種動物血凝抗體的檢測 于接種前和接種后1d、7d、14d、21d、28d分別采集綿羊血液，分離血清，進行血凝抑制實驗。

1.8 間接ELISA法檢測接種動物血清特異性IgG抗體 于接種前和接種后1d、7d、14d、21d、28d分別采集綿羊血液，分離血清。采用間接ELISA法檢測接種綿羊血清特異性IgG抗體效價。即以純化的NDV Clone-30株為包被抗原，1∶2000稀釋的鼠抗羊IgG作為二抗，TMB為顯色液，測定綿羊血清中NDV抗體的效價。

1.9 微量中和實驗檢測接種動物血清中和抗體 96孔板中每孔加入50μL病毒稀釋液。第1孔加入200TCID50/100μL病毒工作液，做系列倍比稀釋。第一排中再加入40μL病毒稀釋液。加入10μL待檢血清于第A2～A11孔，做倍比稀釋。其中A2列各孔加入同倍稀釋的PBS組綿羊血清，為陰性血清對照。第12列為細胞對照，每孔加入50μL病毒稀釋液(4孔)。其它所有孔均加入50μL不同濃度稀釋的病毒，使體積至100μL/孔。搖勻病毒-血清混合物，37℃作用2h。微量板中每孔加入細胞液，混勻后于37℃溫箱孵育，每日觀察細胞病變，3d～4d根據(jù)最終病變結(jié)果判定血清中和抗體滴度。

2 結(jié) 果

2.1 接種綿羊安全性試驗結(jié)果 安全試驗結(jié)果顯示，空白對照組動物、滴鼻接種組所有動物和氣管接種組的4只動物在整個研究過程中肛溫均處于正常值范圍內(nèi)。而NDV氣管灌注接種組的3號羊肛溫在39℃～39.8℃的范圍內(nèi)。臨床表現(xiàn)嗜睡，反應遲緩，但其整個過程中食欲未減。

2.2 接種綿羊排毒檢測結(jié)果 將接種前和接種后1d～10d的綿羊鼻拭子和肛拭子浸于抗生素水中，分別接種10日齡SPF雞胚并傳代兩次后取尿囊液做血凝試驗，結(jié)果顯示氣管接種組5號羊的肛拭子有排毒反應，其它接種綿羊均無排毒反應(表1)。

表1 血凝試驗(HA)檢測NDV Clone-30株接種綿羊排毒結(jié)果Table 1Virus shedding of NDV Clone-30isolate inoculated sheeps detected by hemagglutination test(HA)

2.3 接種綿羊血液中NDV檢測結(jié)果 經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，所有接種綿羊在接種前和接種后1d、3d、5d、7d、14d、21d的血液 RT-PCR 結(jié)果均為陰性；而28d氣管免疫組的4號羊血液RT-PCR檢測結(jié)果為弱陽性(圖1)。

2.4 RT-PCR檢測NDV敏感性試驗結(jié)果 將10-6TCID50的NDV尿囊液提取的 RNA 10倍連續(xù)稀釋后，進行RT-PCR，結(jié)果表明，該引物能檢測出的最低NDV量約為1TCID50(圖2)。

2.5 接種綿羊血凝抑制抗體檢測結(jié)果 接種綿羊的血凝抑制抗體效價結(jié)果顯示，所有接種動物都產(chǎn)生較高的血凝抑制抗體，而未接種的對照組綿羊沒有產(chǎn)生血凝抑制抗體(p<0.05)(圖3)。

2.6 接種動物血清特異性抗NDV IgG抗體檢測結(jié)果 通過間接ELISA檢測接種前后1d、7d、14d、21d綿羊血清的IgG抗體結(jié)果顯示，接種綿羊均不同程度的產(chǎn)生血清特異性IgG抗體，與對照組對比差異顯著(p<0.05)，并且抗體水平隨著接種時間延長而增長，21d和28d抗體水平達到峰值(圖4)。

2.7 接種動物血清中和抗體檢測結(jié)果 采用微量中和試驗檢測接種羊血清中和抗體滴度，NDV Clone-30株接種組綿羊血清均不同程度產(chǎn)生了中和抗體。滴鼻接種組達1∶152、氣管接種組達1∶320。與對照組對比差異顯著(p<0.05)。取接種后28d各組綿羊血清中和抗體常用對數(shù)值作柱形圖(圖5)。

4 討 論

近年來，NDV做為一種新型病毒載體，在疫苗研究領(lǐng)域的應用非常廣泛。本研究選擇生產(chǎn)實踐中廣泛應用、免疫效果良好的一株NDV Clone-30弱毒疫苗株分滴鼻和氣管灌注兩條途徑免疫綿羊，通過實驗評價NDV做為羊類傳染病疫苗載體的可能。

接種動物檢測結(jié)果顯示，NDV在接種綿羊體內(nèi)未形成毒血癥。血凝抑制試驗檢結(jié)果顯示，除空白對照組動物外，滴鼻接種組和氣管接種組綿羊都檢測出了NDV特異性神經(jīng)氨酸酶抗體。微量中和試驗檢測結(jié)檢測出滴鼻接種組和氣管接種組綿羊都產(chǎn)生不同程度的中和抗體。ELISA實驗檢測到NDV特異性IgG抗體滴度很高，其對血凝抑制抗體和中和抗體的滴度有直接影響。兩種接種途徑比較，滴鼻接種組比氣管接種組更安全，而兩種接種途徑的抗體產(chǎn)生情況基本無差別。

本實驗結(jié)果表明，用NDV適量感染綿羊安全可靠，并可有效地誘導機體系統(tǒng)免疫應答。NDV可作為宿主限制性疫苗載體用于預防無特效疫苗的羊類疾病，且與氣管灌注接種途徑比，滴鼻接種途徑相對安全。本研究為進一步拓寬NDV做為疫苗載體的應用研究奠定重要實驗基礎(chǔ)，為NDV載體的新型羊類傳染病疫苗的研制提供了可靠試驗依據(jù)。

[1]Mayo M.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch.Virol,2002,147:1655-1656.

[2]De Leeuw O,Peeters B.Complete nucleotide sequence of Newcastle disease virus:evidence for the existence of a new genus within the subfamily Paramyx ovirinae[J].JGen Virol,1999;80(1):131-136.

[3]Bukreyev A,Huang Zhu-hui,Yang Li-juan,et al.Recombinant Newcastle disease virus expressing a foreign viral antigen is attenuated and highly immunogenic in primates[J].JVirol,2005,79:13275-13284.

[4]Subbiah M,Yan Y,Rockemann D,et al.Experimental infection of calves w ith Newcastle disease virus induces system ic and mucosal antibody responses[J].Arch Virol,2008,153:1197-1200.

[5]Huang Zhu-hui,Krishnamurthy S,Panda A,et a1.High level expression of a foreign gene from the most 30proximal locus of a recombinant Newcastle disease virus[J].J Gen Virol,2001,82:1729-1736.

[6]Peeters B P,de Leeuw O S,Koch G,et a1.Rescue of Newcastle disease virus from cloned cdna:evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[J].Virology,1999,73:5001-5009.

[7]Krishnamurthy S,Huang Zhu-hui,Samal S K.Recovery of avirulent strain of Newcastle disease virus from cloned cDNA:expression of a foreign gene results in grow th retardation and attenuation[J].Virology,2000,278:168-182.

[8]Liu Y L,Hu S L,Zhang Y M,et a1.Generation of a velogenic Newcastle disease virus from cDNA and expression of the green fluorescent protein[J].Arch Virol,2007,152:1241-1249.

[9]Hofstad M S.Experimental inoculation of sw ine and sheep with Newcastle disease virus[J].Cornell Vet,1950,40:190-196.