曾憲斌，熊永忠，賈 坤，張敦偉，佘利旋，夏惠焰，遠(yuǎn)立國(guó)，李守軍*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱150069)

犬布氏桿菌病(Canine Brucellosis)是由犬布氏桿菌(Brucella canis)引起的人畜共患傳染病。B.canis為粗糙型布氏桿菌，革蘭氏染色陰性。1966年Leland Carmichael首次分離到 B.canis。在我國(guó)，1984年尚德秋首次分離到B.canis。B.canis主要感染狗，還可以感染人、猴和兔。主要侵害宿主的生殖系統(tǒng)，引起感染宿主的不育，懷孕母畜流產(chǎn)，公畜附睪炎和前列腺炎，另外還可以引起全身性的淋巴結(jié)炎和眼葡萄膜炎。

犬布氏桿菌病的診斷方法有很多種，常用的有細(xì)菌分離培養(yǎng)、試管凝集試驗(yàn)(TAT)、玻板凝集試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)和瓊脂免疫凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)，但這些方法均存在一定缺陷。ELISA方法作為一種快速、敏感、特異的檢測(cè)方法，是公認(rèn)的較有效的布氏桿菌病(Brucellosis)檢測(cè)方法。目前只有牛種和豬種布氏桿菌(Brucella)的ELISA試驗(yàn)是國(guó)際貿(mào)易中的指定試驗(yàn)。綿羊副睪種Brucella也已有成熟的ELISA診斷技術(shù)[1]。ELISA方法在檢測(cè)B.canis上的應(yīng)用還需進(jìn)一步改進(jìn)抗原和積累數(shù)據(jù)。Cu/Zn-SOD是Brucella除沙林鼠種和豬種Brucella生物2型外，各生物型均表達(dá)的一個(gè)蛋白，是建立B.canisELISA檢測(cè)方法的候選抗原之一。本研究表達(dá)、純化了B.canis重組Cu/Zn-SOD蛋白，并檢測(cè)其免疫原性，為研究Cu/Zn-SOD蛋白在B.canis的ELISA檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 B.canis及陰性犬血清由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；B.canis陽(yáng)性血清由北京畜牧獸醫(yī)研究所提供；pMD18-T Simple Vector、pET-28a(+)Vector、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；膠回收小量試劑盒購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗犬IgG購(gòu)自JACKSON公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自天根生化科技有限公司；Ni-IDA蛋白純化柱購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBenk登錄的B.canis基因序列(ATCC 23365)，利用Primer 5生物軟件設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增Cu/Zn-SOD基因，引物序列如下：P1：5'-ATGACGACGGTAAAAATGTATGAGG-3'；P2：5'-AAGCTTTTATTCGATCACGCCGCAG-3'，劃線部分分別為EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為462 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 Cu/Zn-SOD基因的PCR擴(kuò)增 提取B.canis基因組DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、61℃ 40 s、72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 Cu/Zn-SOD基因PCR產(chǎn)物的克隆 將純化的PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T載體中，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)后挑取白色單菌落，對(duì)菌液PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與原序列進(jìn)行比較分析。重組克隆質(zhì)粒命名為pMD-SOD。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 按E.N.Z.A質(zhì)粒小量抽提試劑盒說(shuō)明書抽提重組質(zhì)粒pMD-SOD，采用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切并回收SOD基因，再將回收的SOD基因連接到經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α。重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-SOD。對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE和western blot分析 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-SOD轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。于誘導(dǎo)后6 h取菌液進(jìn)行SDS-PAGE和western blot鑒定。

1.7 SOD蛋白的純化及多克隆抗體的制備 將含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-SOD的BL21(DE3)菌液按1%比例接種于含卡那霉素(100 μg/mL)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為1.0 mmol/L的無(wú)菌IPTG誘導(dǎo)。收集菌體，超聲破碎。按Ni-IDA蛋白純化柱說(shuō)明書對(duì)超聲上清液進(jìn)行純化。將純化蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻(蛋白終濃度為0.5mg/mL)，新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射，每只3 mL。第2周和第4周分別將純化蛋白與等體積不完全弗氏佐劑充分混勻(蛋白終濃度為0.5 mg/mL)進(jìn)行第2次和第3次免疫。在一免、二免、三免后第14 d分別耳靜脈采血，離心收集血清，進(jìn)行western blot分析。三免后第14 d頸靜脈采血，離心收集血清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1 Cu/Zn-SOD基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 Cu/Zn-SOD基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得條帶與預(yù)期產(chǎn)物大小一致(圖 1)。

對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的菌擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒。pET-SOD重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，得到約5300 bp和460 bp的片段，表明構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-SOD。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的pET-SOD/BL21菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，在20 ku左右出現(xiàn)一條明顯的條帶，與預(yù)期大小一致，表明該基因片段在大腸桿菌BL21中得到表達(dá)(圖2)。

2.3 Western blot檢測(cè) 重組表達(dá)蛋白進(jìn)行western blot反應(yīng)，結(jié)果顯示，20 ku處出現(xiàn)一條明顯的印跡，表明重組蛋白可以被B.canis陽(yáng)性血清識(shí)別，具有良好的抗原性(圖3)。

2.4 兔抗Cu/Zn-SOD多克隆抗體的western blot分析 分別以一免、二免、三免第14 d的血清(1∶100稀釋)作為一抗進(jìn)行western blot分析，結(jié)果表明在20 ku處均出現(xiàn)條帶，二免、三免第14 d抗體效價(jià)達(dá)到最高(圖4)。

3 討論

1999年～2007年間，日本報(bào)道了11例Brucellosis患者，其中7例由B.canis引起[2]。2008年，在日本又發(fā)現(xiàn)了兩例感染B.canis的患者[3]。在我國(guó)，隨著寵物行業(yè)的發(fā)展，B.canis對(duì)人類的健康威脅也越來(lái)越大。2009年何丹運(yùn)用試管凝集試驗(yàn)和虎紅平板凝集試驗(yàn)，對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院臨床采集的415份犬血清樣品進(jìn)行犬布氏桿菌病血清學(xué)檢測(cè)，檢出陽(yáng)性血清1例[4]。2006年樸東日從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比格犬中分離出2株B.canis，可見在中國(guó)部分地區(qū)存在B.canis的感染[5]。因此，深入研究B.canis致病機(jī)制和建立早期B.canis感染的快速檢測(cè)方法顯得越來(lái)越重要。目前，ELISA方法是公認(rèn)檢測(cè)B.canis較有效的方法，而選擇合適的抗原是建立ELISA方法的關(guān)鍵。

Cu/Zn-SOD在Brucella的致病性和介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)方面的作用還存在爭(zhēng)議，可能原因是在光滑型Brucella中，其主要的毒力因子是LPS-O側(cè)鏈，在該因子的存在下，Cu/Zn-SOD的毒力被掩蓋而檢測(cè)不到，另外BrucellaCu/Zn-SOD與真核生物宿主存在部分同源性，所以很可能對(duì)部分同源的抗原產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)要比外源性抗原的時(shí)間長(zhǎng)[6-9]。本研究中利用重組表達(dá)的Cu/Zn-SOD蛋白為抗原可以檢測(cè)B.canis陽(yáng)性血清中的Cu/Zn-SOD的抗體。分析可能原因有：(1)B.canis是粗糙型Brucella，缺乏LPS-O側(cè)鏈，所以Cu/Zn-SOD的作用不會(huì)被掩蓋；(2)患犬感染B.canis的時(shí)間比較長(zhǎng)，足以產(chǎn)生抗Cu/Zn-SOD的抗體。

本研究構(gòu)建了B.canisCu/Zn-SOD基因的原核表達(dá)載體pET-SOD，將其進(jìn)行表達(dá)、純化和western blot分析，重組蛋白Cu/Zn-SOD與B.canis陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；并制備了兔抗B.canis Cu/Zn-SOD多克隆抗體，經(jīng)western blot分析表明，該多克隆抗體可以與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，表明重組蛋白抗原性良好，為B.canisCu/Zn-SOD蛋白的免疫保護(hù)性研究和Cu/Zn-SOD蛋白在B.canis ELISA檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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