任海松，張秀美，胡北俠，許傳田，楊少華，朱雯迎，李建亮，崔言順*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018；2.山東農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100)

雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis，IB)是由IB病毒(IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性、傳染性呼吸道疾病。IBV基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)約27.6kb。該病毒含有3種主要結(jié)構(gòu)蛋白：即纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)。S蛋白位于IBV粒子的表面，由S1和S2兩個(gè)亞單位組成，其中S1基因是IBV基因組中最容易發(fā)生變異的基因，而S1蛋白是血清中和抗體的主要誘導(dǎo)者，是決定IBV血清型特異性的主要蛋白。N蛋白在病毒的組裝和復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且N蛋白是重要的免疫原，在刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫中起重要作用。M蛋白與病毒的復(fù)制有關(guān)，控制并介導(dǎo)病毒粒子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜出芽，在病毒裝配期間將核衣殼連接到囊膜上，在有補(bǔ)體存在的情況下可以中和病毒的感染。此外，M蛋白還與抗感染、誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素等有關(guān)。

本研究2006年～2010年從山東省發(fā)病雞群中分離鑒定了17個(gè)IBV流行株，通過(guò)對(duì)S1基因、N基因和M基因序列測(cè)定和分析，探討山東省IBV分子特征和遺傳變異規(guī)律，為IB的防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及雞胚 17個(gè)IBV分離株均為本實(shí)驗(yàn)室從山東省不同地區(qū)發(fā)病雞群采集的病料中分離獲得，通過(guò)雞胚傳代保存，并采用雞胚矮小化試驗(yàn)、新城疫干擾試驗(yàn)等方法鑒定。各分離株背景資料及基因序列的GenBank登錄號(hào)見表1。

表1 山東IBV分離株及其S1、N和M基因GenBank登錄號(hào)Table 1Seventeen IBV strains isolated from commercial flocks in Shandong province of China

1.2 引物、菌種、質(zhì)粒和試劑 S1、N和M基因引物序列參考文獻(xiàn)[1]和[2]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；pEASY-T1載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、TRIzol和Gel Ext raction Kit均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DH5α菌種為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 病毒增殖及RNA的提取 將IBV分離株分別接種9日齡～11日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)72h(棄去24h內(nèi)死亡的雞胚)，無(wú)菌收集尿囊液，離心，按TRIzol試劑說(shuō)明書提取病毒基因組RNA。

1.4 IBV分離株S1、N和M基因的擴(kuò)增、克隆與鑒定 應(yīng)用RT-PCR方法，擴(kuò)增17株IBV分離株S1基因和N基因?；厥誔CR產(chǎn)物并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌液PCR初步鑒定后，由北京六和華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.5 S1、N和M基因核苷酸序列的比較分析 利用Lasergene7.0軟件，將17個(gè)IBV分離株S1、N和M基因分別與GenBank中IBV參考株的S1、N和M基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié) 果

2.1 S1基因序列及遺傳進(jìn)化分析 17個(gè)IBV分離株S1基因序列分析結(jié)果表明：其中14個(gè)分離株S1基因的ORF長(zhǎng)度為1620bp，分別編碼540個(gè)氨基酸(包括蛋白酶裂解位點(diǎn))；分離株SDTA06111和SDYT0605S1基因ORF長(zhǎng)度為1611bp，編碼537個(gè)氨基酸；CK/CH/SD09/005株S1基因ORF長(zhǎng)度為1640bp，編碼546個(gè)氨基酸；17個(gè)分離株間S1基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為58.2%～98.9%和67.1%～99.8%。與參考病毒株核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為56.6%～99.1%和64.0%～99.8%。

根據(jù)S1基因核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹顯示：17個(gè)分離株和25個(gè)參考病毒株共形成4個(gè)進(jìn)化群。SDYT0605和SDTA06111株與 H120、MA5和T株等參考病毒株形成基因Ⅰ群。第Ⅱ基因群以491為代表，包括UK793和Gray等分離株。14個(gè)分離株與國(guó)內(nèi)近年來(lái)分離的參考株形成以LX4(AY189157)為代表的第Ⅲ基因群。其中分離株CK/CH/SD09/005和參考株TC07-2形成獨(dú)立的第Ⅳ基因群(圖1)。以我國(guó)常用疫苗株H120為參考，17個(gè)分離株S1基因存在廣泛的基因突變和氨基酸替代現(xiàn)象，除與H120處于同一基因群的SDYT0605和SDTA06111外，15個(gè)分離株在24(A/D)和122位～123位(GS/DS/GI)位共插入3個(gè)氨基酸，其中分離株 CK/CH/SD09/005還在 96(R)、141(D)和 289位～292位(QKER)位共插入6個(gè)氨基酸(圖略)。

2.2 N基因序列及遺傳進(jìn)化分析 17個(gè)分離株的N基因均擴(kuò)增出目的片段，測(cè)序結(jié)果均為1230bp，編碼409個(gè)氨基酸。其核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為85.9%～99.5%和85.9%～99.8%；分離株與參考株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為83.8%～98.9%和86.3%～98.9%。與我國(guó)常用疫苗株H120進(jìn)行比較顯示，17個(gè)分離株的N基因序列均無(wú)堿基的缺失和插入現(xiàn)象，但存在點(diǎn)突變和氨基酸的替代。

根據(jù)N基因繪制的遺傳進(jìn)化樹顯示，分離株與17個(gè)參考株形成2個(gè)進(jìn)化群。其中14個(gè)分離株屬于以LX4為代表的基因Ⅰ群，SDYT0605、SDWF0608和CK/CH/SD09/0053個(gè)分離株與H120等參考株屬于基因Ⅱ群(圖2)。

2.3 M基因序列及遺傳進(jìn)化分析 17個(gè)分離株M基因測(cè)序結(jié)果顯示：分離株CK/CH/SD09/005的M基因片段長(zhǎng)度為681bp，編碼226個(gè)氨基酸；剩余16個(gè)分離株的M基因片段長(zhǎng)度均為678bp，編碼225個(gè)氨基酸。分離株與參考株核苷酸和氨基酸同源性分別為87.5%～98.2%和88.5%～98.2%。多數(shù)分離株之間同源性較高，其中SDWF0711、SDZB0808、CK/CH/SD09/003與 CK/CK/SD09/006以及CK/CH/SD09/002與CK/CH/SD10/001核苷酸同源性分別為100%。以疫苗株H120為參考株，對(duì)其M基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，除分離株CK/CH/SD09/005插入了一個(gè)氨基酸外，多數(shù)分離株僅存在少數(shù)氨基酸的替代現(xiàn)象，并且多數(shù)替代發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始后的前100個(gè)氨基酸內(nèi)。

根據(jù)M基因核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹顯示：17個(gè)分離株和14個(gè)參考株形成4個(gè)進(jìn)化群；其中，15個(gè)分離株和參考株形成以LX4為代表的基因Ⅰ群；基因Ⅱ群由Gray、Connecticut和GX2-98等參考株組成；分離株SDYT0605與疫苗株H120等組成基因Ⅲ群；分離株CK/CH/SD09/005獨(dú)自構(gòu)成一個(gè)分支(圖3)。

3 討論

由于IBV基因組核苷酸的高突變率和變異機(jī)制，導(dǎo)致新的血清型和變異株不斷出現(xiàn)，目前為止IBV存在20多個(gè)血清型，并且各血清型之間缺乏或者無(wú)交叉保護(hù)[3-5]，給IB的防制造成困難，也導(dǎo)致IB在免疫雞群中不斷爆發(fā)。因此，對(duì)IB流行株分子變異規(guī)律進(jìn)行研究，選擇合適的疫苗株，對(duì)防止IB的爆發(fā)具有重要的作用。

S1是病毒的主要免疫原蛋白，S1基因在高變區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變和適應(yīng)性進(jìn)化是IBV抗原性變異的主要原因。研究表明，與IBV中和抗體產(chǎn)生有關(guān)的5個(gè)抗原位點(diǎn)分別位于S1蛋白的24位～61位、132位～149位和291位～398位氨基酸區(qū)域[6-8]；S1基因序列比對(duì)顯示：與疫苗株H120相比，除2006年的兩個(gè)分離株(SDTA06111、SDYT0605)與疫苗株H120氨基酸同源性較高(98.8%和99.5%)外，其他分離株在上述3個(gè)抗原區(qū)域存在廣泛的基因突變以及氨基酸替代和插入現(xiàn)象。在抗原表位區(qū)如此多的變異很可能引起病毒抗原性和血清型的改變，導(dǎo)致疫苗免疫失敗。相對(duì)于S1基因，N基因和M基因相對(duì)保守。N基因主要以廣泛的點(diǎn)突變?yōu)橹?，無(wú)核苷酸的插入和缺失，這與路希山[1]報(bào)道一致。分離株M基因與參考株之間的同源性較高，部分分離株之間M蛋白氨基酸的同源性高達(dá)100%，在一定程度上表明它們可能具有相同的來(lái)源。

綜合S1、N和M基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明：2006年分離的4個(gè)分離株中有3個(gè)分離株(SDYT0605、DYT06111和 SDWF0608)的 S1基因、N基因或M基因與H120等疫苗株遺傳關(guān)系較近，屬同一個(gè)進(jìn)化分支；2007年～2010年分離的病毒株多數(shù)3種基因在進(jìn)化關(guān)系上平行，與國(guó)內(nèi)分離株LX4同屬一個(gè)基因群，而與疫苗株關(guān)系較遠(yuǎn)?？梢?006年～2010年間，IBV在山東省流行趨勢(shì)發(fā)生了變化：2006年期間，疫苗株H120的基因變異株可能是山東省主要的流行株；而2007年～2010年，以LX4為代表的流行株則是山東省IBV流行的優(yōu)勢(shì)基因型。

在疫苗的長(zhǎng)期免疫壓力下，山東省IBV一直在通過(guò)基因突變、插入、缺失以及基因重組不斷產(chǎn)生新的變異株或血清型[9-11]。因此，在對(duì)IBV流行株進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè)的同時(shí)，完善養(yǎng)殖場(chǎng)的各項(xiàng)生物安全措施對(duì)于IB的科學(xué)防控具有重要意義。

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