鄒艷麗，趙永剛，張永強(qiáng)，包靜月，孫成友，王君瑋，李金明，王志亮

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病診斷中心，山東青島 266032 ）

西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）是黃病毒科黃病毒屬成員，它會(huì)引起人畜共患病[1]。因于1937年首次從非洲烏干達(dá)西尼羅河地區(qū)一名發(fā)熱婦女血液中分離到而得名[2]。與日本腦炎病毒、墨累河谷腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒和昆津病毒同屬日本腦炎病毒血清群。該病毒是蚊媒病毒，主要經(jīng)庫(kù)蚊傳播給人、馬和鳥類等，可引發(fā)西尼羅河熱和致死性的西尼羅河病毒性腦膜腦炎，其中西尼羅河熱被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為重大疫病。西尼羅河病毒分布廣泛，1950年埃及3名兒童的血液中分離到病毒，60年代早期第一次報(bào)道從埃及和法國(guó)的馬中分離到病毒[3]。據(jù)報(bào)道，已從以色列、南非、剛果、印度等地分離到病毒，此后西尼羅河病廣泛分布于非洲和中東。近幾年，阿爾及利亞（1994）、羅馬尼亞（1967—1997）、捷克（1997）、剛果（1998）、俄羅斯、美國(guó)（1999）都先后暴發(fā)過(guò)西尼羅河熱[4]。在世界上許多國(guó)家和地區(qū)引起流行，造成人、馬和鳥類的大量感染及死亡，給發(fā)病國(guó)家造成重大危害，成為全球獸醫(yī)界和公共衛(wèi)生部門的一大難題。我國(guó)目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)西尼羅河病毒，但存在傳入的風(fēng)險(xiǎn)，因此建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于我國(guó)預(yù)防該病毒的入侵具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 質(zhì)粒DH5α購(gòu)自大連寶生物公司，EII基因由上海生工合成并克隆到PUC59載體上。PGEM-T-easy載體購(gòu)自Promega公司。

1.1.2 主要試劑 普通PCR試劑盒、RT-PCR試劑盒、DL2000均購(gòu)自TaKaRa公司，膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜公司，Riboprobe System-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)WNV毒株的EII蛋白基因序列，設(shè)計(jì)引物。

WNV5ST75′- TAATACGACTCTATAGGGCGATTT TTTTTTTTTTTTATGGGAGAAGCT CAC AAT GAC-3′；WNV6R 5′- GCAAGGTCCATCCGTGCCAGTGTAC-3′

在上游引物的5'端引入T7啟動(dòng)子。引物由大連寶生物工程公司合成。

1.2.2 序列合成 根據(jù)大腸桿菌表達(dá)密碼子偏愛(ài)性和密碼子的簡(jiǎn)并性修改并合成序列。

ATG GGA GAA GCT CAC AAT GAC AAA CGT GCT GAC CCA GCT TTT GTG TGC CGTCAA GGA GTG GTG GAC CGT GGC TGG GGC AAC GGC TGC GGA CTG TTT GGC AAA GGA AGC ATT GAC ACA TGC GCC AAA TTT GCC TGC TCT ACC AAG GCA ATC GGACG T ACC ATC TTG AAA GAG AAT ATC AAG TAC GAA GTG GCC ATT TTT GTC CAT GGACCA ACT ACT GTG GAG TCG CAC GGA AAC TAC TCC ACA CAG GCT GGA GCC ACT CAG GCA GGG CGT TTC AGC ATC ACT CCT GCG GCG CCT TCA TAC ACA CTG AAG CTT GGA GAA TAT GGA GAG GTG ACA GTG GAC TGC GAA CCA CGT TCA GGG ATT GAC ACC AAT GCA TAC TAC GTG ATG ACT GTT GGA ACA AAG ACG TTC TTG GTC CAT CGT GAG TGG TTC ATG GAC CTC AAC CTC CCT TGG AGC AGT GCT GGA AGT ACT GTG TGG CGT AAC CGT GAG ACG TTA ATG GAG TTT GAG GAA CCA CAC GCC ACG AAG CAG TCT GTG ATC GCA TTG GGC TCA CAA GAG GGA GCT CTG CAT CAA GCT TTG GCT GGA GCC ATT CCT GTG GAA TTT TCA AGC AAC ACT GTC AAG TTG ACG TCG GGT CAT TTG AAG TGC CGT GTG AAG ATG GAA AAA TTG CAG TTG AAG GGA ACA ACC TAT GGC GTC TGC TCA AAG GCT TTC AAG TTT CTT GGG ACT CCGGCA GAC ACA GGT CAC GGC ACT GTG GTG TTG GAA TTG CAG TAC ACT GGC ACG GAT GGA CCT TGC

1.2.3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為：DNA 1 μL，上下游 引 物（25 pmol）各 1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 18.5 μL，總體系25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸7 min。

1.2.4 連接與轉(zhuǎn)化 在T4 DNA連接酶作用下，純化的PCR產(chǎn)物與PGEM-T easy載體于25 ℃連接1 h后，用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)胞中。

1.2.5 重組質(zhì)粒篩選與鑒定 使用藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選重組質(zhì)粒，挑取白色菌落轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素100 μg/mL的LB培養(yǎng)液中，37 ℃，210 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA。以質(zhì)粒為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢查插入片段的大小，根據(jù)目的片段大小來(lái)判定其陽(yáng)性，送交上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.6 重組質(zhì)粒載體的線性化處理與濃度測(cè)定 質(zhì)粒用NdeⅠ內(nèi)切酶經(jīng)37℃消化2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，觀察線性化結(jié)果。

1.2.7 體外轉(zhuǎn)錄、模板RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 利用Riboprobe System-T7試劑盒，室溫配制20 μL反應(yīng)體系：5×Buffer 4 μL，DTT （100 mmol/L）2 μL，RNasin（40U）1 μL，rNTP （終濃度各為0.5 mmol/L）5 μL，線性化質(zhì)粒（0.3 μg/μL） 2 μL，T7 poly（18 U）1 μL，DEPC H2O 5.5 μL。反應(yīng)條件為 37 ℃ 1 h。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加Dnase（1 U/μL）1.5 μL繼續(xù)反應(yīng)20 min除去DNA模板，用RNA轉(zhuǎn)錄純化試劑盒進(jìn)行純化并用NanoDrop ND1000分光光度計(jì)定量。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度可以換算為拷貝/μL?？截悢?shù)=濃度×阿伏加德羅常數(shù)/ （1個(gè)堿基對(duì)的平均分子質(zhì)量×總長(zhǎng)度），阿伏加德羅常數(shù)為6.02×1023。用DEPC水將其分別依次梯度稀釋，取各稀釋液作模板，進(jìn)行RT-PCR，引物和擴(kuò)增條件與前述步驟相同。分裝作為標(biāo)準(zhǔn)品，-80 ℃凍存。

2 結(jié)果

2.1 西尼羅河熱病毒基因重組質(zhì)粒的PCR鑒定

以Trizol提取的RNA為模板，用WNV5ST7，WNV6R為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后應(yīng)得818 bp長(zhǎng)的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的目的片段大小與預(yù)期值相符合（圖1）。

2.2 測(cè)序結(jié)果比對(duì)

登錄Genebank，將質(zhì)粒插入片段的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，克隆的DNA序列與合成的基因序列相應(yīng)片段的同源性100%，證實(shí)堿基序列正確，能夠進(jìn)入下一步的體外轉(zhuǎn)錄等試驗(yàn)。

2.3 cRNA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度測(cè)定

體外轉(zhuǎn)錄的cRNA經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定，其質(zhì)量濃度為352.6 ng/μL，D260 nm/D 280 nm 分別為1.92。根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式，將其梯度稀釋為5.0×1011～5.0×102拷貝 /μL-80℃保存。

2.4 體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果鑒定

以梯度稀釋的體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物作模板，作RTPCR。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RT-PCR電泳結(jié)果見圖2。由圖可知，PCR產(chǎn)物為818 bp，且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量濃度5.0×102拷貝/μL時(shí)，仍出現(xiàn)清晰目的條帶，在質(zhì)量濃度為5.0×102拷貝/μL時(shí)均出現(xiàn)清晰目的條帶。

3 討論

建立特異、敏感、快速的西尼羅河熱病原診斷方法，是我國(guó)對(duì)外來(lái)疫病西尼羅河熱防控技術(shù)儲(chǔ)備需要。我們?yōu)榇酥苽淞宋髂崃_河熱病毒的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，為以后的檢測(cè)作陽(yáng)性對(duì)照來(lái)用。

本研究采用構(gòu)建含有T7啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，直接用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA片段，并準(zhǔn)確定量，可作為西尼羅河熱病毒的核酸擴(kuò)增快速診檢技術(shù)方法的陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)生物安全隱患。同時(shí)也避免了以往研制的商品化試劑盒中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不能很好地對(duì)樣品處理及逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行有效控制的問(wèn)題[5-6]。

本研究成功克隆了西尼羅河熱病毒的保守基因，并構(gòu)建了相應(yīng)的重組質(zhì)粒，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得了陽(yáng)性RNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行了準(zhǔn)確定量，為進(jìn)一步開展西尼羅河熱病毒的功能、結(jié)構(gòu)等研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為后續(xù)建立和優(yōu)化西尼羅河熱病毒核酸快速檢測(cè)的方法學(xué)研究，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)等，提供了基礎(chǔ)。

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