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        我國部分地區(qū)傳染性羊癢病基因型的分布情況調(diào)查

        2011-08-16 07:44:28董志珍欒慎順陳本龍
        中國動物檢疫 2011年12期
        關(guān)鍵詞:檢測

        肖 妍,董志珍,欒慎順,陳本龍

        (天津出入境檢驗檢疫局,天津 300461)

        羊癢病(scrapie)是傳染性海綿狀腦?。═SE)的原型,是由羊癢病朊病毒引起成年綿羊和山羊的一種慢性進(jìn)行性的、致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,能引起綿羊和山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退化變性,病羊具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、空泡化、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等特點,瘙癢是癢病的一個顯著特征,此外, 共濟(jì)失調(diào)、麻痹、衰弱、震顫、姿勢不穩(wěn)、癡呆、知覺過敏、行為異常等神經(jīng)癥狀也是其主要的臨床癥狀,死亡率達(dá)100%[1-3]。

        羊癢病可通過病羊的肉骨粉等傳染給牛,而使牛感染為瘋牛病。人食用了被瘋牛病病原污染的食品,可感染上傳染性海綿狀腦病—新變異型克雅氏?。磏vCJD)。因此,羊癢病的診斷是根除和控制瘋牛病、克雅氏病的關(guān)鍵。而到目前為止,在檢測瘋牛病和羊癢病等方面開發(fā)出的免疫組織化學(xué)方法、免疫轉(zhuǎn)印方法、組織印記法、ELISA方法、western-blot等方法均為死后診斷和確診法,不利于本病的控制和根除[4-5]。

        引起羊癢病的病原是一種無核酸的蛋白質(zhì)侵染顆粒朊蛋白(Prion protein, PrP),是由宿主神經(jīng)細(xì)胞表面正常的一種唾液酸糖蛋白(PrPc)在三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后形成的異常蛋白(PrPsc),由于英國“瘋牛病”的發(fā)生使得此蛋白備受研究人員的關(guān)注[6-7]。

        研究表明, 羊癢病的發(fā)生與綿羊朊蛋白編碼基因PRNP遺傳多樣性密切相關(guān),主要表現(xiàn)在綿羊PRNP第136、154和171位密碼子組成的PRNP基因型與綿羊?qū)ΠW病的抗病性相關(guān)[8-10]?;加蠺SE的病羊其基因組中的三個等位基因發(fā)生了突變,即136位點上的A突變成了V、154位點上的R基因突變成了H基因,171位點上的Q基因突變成了R或H,研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型,具有此基因型的羊基本上不會感染TSE,而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊則為敏感型,易患TSE[11-13]。也有研究稱含有雜合子VRQ/ARR基因型的羊感染了羊癢病,但是當(dāng)有ARR等位基因和非VRQ等位基因伴隨時,羊很少有感染羊癢病的報道。本研究旨在利用已建立的利用熒光定量PCR擴增反應(yīng)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)快速分析的方法對羊癢病抗性基因進(jìn)行篩選,對我國部分地區(qū)的羊癢病基因型分布情況進(jìn)行調(diào)查,從而從品種選育水平上杜絕羊癢病的發(fā)生。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        各型綿羊PRNP基因標(biāo)準(zhǔn)品由意大利Institut zooprofi lattic sperimen DELLA SARDEGNA 惠贈 ;基因擴增預(yù)混液Taqman Universal PCR MasterMix購于Applied Biosystems試劑公司;基因組DNA提取試劑盒購于TIANGEN試劑公司。

        1.2 綿羊基因組DNA的提取

        按照TIANGEN血液基因組 DNA提取試劑盒說明提取。

        1.3 熒光定量PCR檢測

        選 取 20 μL PCR 反 應(yīng) 體 系 :2×mastermix:10μL;DNA:2 μL;上游引物(10 μM):2 μL;下游引物(10 μM):2 μL;FAM標(biāo)記的探針(10 μM):0.5μL;VIC 標(biāo)記的探針(10 μM):0.5 μL;雙蒸水補齊至 20 μL。

        樣品放入Roche LightCycler 480熒光定量PCR擴增儀進(jìn)行檢測,其實時熒光定量PCR擴增程序如下 :50 ℃ 2 min ;95 ℃ 10 min ;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共35~40個循環(huán),每個循環(huán)延伸末期采集數(shù)據(jù)。

        反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行終點讀板分型,選擇標(biāo)記探針的兩種檢測信號FAM和VIC,程序如下:61 ℃預(yù)熱1 s,60 ℃連續(xù)讀板,同時收集5個信號。

        機器將根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)將兩種熒光信號進(jìn)行比較計算,自動分型。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 實時熒光定量PCR 的擴增

        采用終點讀板基因分型模式(Endpoint Genotyping)檢測483~533 nm通道(FAM)和523~568 nm通道(VIC)的數(shù)據(jù),經(jīng)過計算比較二者的比值,得到基因分型散點圖(見圖1)。各標(biāo)準(zhǔn)品均按其基因型表現(xiàn)為純合子(136AA、136VV、154RR、154HH、171RR、171HH、171QQ)及雜合子(136VA、154RH、171RH、171RQ和171HQ),說明引物及探針設(shè)計的特異性完全能夠用于SNP快速分析。

        2.2 樣本檢測結(jié)果

        表 1 樣本檢測結(jié)果

        基因型分布情況見圖2~7。

        3 討論

        綿羊的基因型與發(fā)生羊癢病有著重要的關(guān)系,如表1所列[14]。

        不同PrP基因型對羊癢病的敏感性不同,因此篩選出對TSE有抗性的羊群是控制和根除本病的關(guān)鍵,目前的科學(xué)研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型,具有此基因型的羊基本上不會感染TSE,而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊則為敏感型,易患TSE,因此可根據(jù)朊蛋白的基因型而采取相應(yīng)的措施和計劃來控制羊癢病、瘋牛病等。

        表 2 綿羊PrP基因型與羊癢病發(fā)生的危險性

        經(jīng)過我們對北京、天津、新疆、云南4個地區(qū)的254份無角多賽特綿羊血液樣本進(jìn)行基因分型試驗,結(jié)果表明,ARR/ARR或ARR/ARQ抗性基因型所占比例為44%;基因型ARR/ARH 所占比例為9%,此基因型對羊癢病有抗性,但育種時要選育;對于羊癢病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例為4%,其中新疆所檢74份樣品中未檢出,北京100份樣品中檢出9份,比例為9%,天津和云南所檢40份樣品中各檢出1份,比例為2.5%。

        對于羊癢病有較高易感性的基因型ARQ/ARQ,ARH/ARQ,ARH/ARH,ARH/AHQ,ARQ/AHQ,AHQ/AHQ所占比例分別為27%,10%,3%,1%,2%和0.4%,由此可見,我國以上四個地區(qū)的無角多賽特綿羊PrP基因型的分析可知,我國飼養(yǎng)的綿羊抗性基因型的比列占到了53%,一半以上的綿羊具有羊癢病抗性,可以用于育種和基因篩選;對于羊癢病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例為4%,對于此基因型的綿羊不能用于育種,應(yīng)將羔羊宰殺或閻割;對于羊癢病有較高易感性的基因型占到了43%,對于此類型的綿羊?qū)ρ虬W病有較小的抗性,可以賣掉或在某一階段用于育種。

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