周嵐 黃云超 王竹 葉聯(lián)華 候文俊 楊凱云

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的疾病,在全球,肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首[1].宣威地區(qū)位于滇東北,是云南省主要產(chǎn)煤基地,肺癌死亡率為91.11/10萬(wàn),是我國(guó)肺癌高發(fā)地區(qū)[2].女性發(fā)病率高、年輕化、家族聚集性明顯是宣威地區(qū)肺癌發(fā)病的主要特點(diǎn)[3].

硒是人類(lèi)必需的微量營(yíng)養(yǎng)素.有研究[4-6]發(fā)現(xiàn)腫瘤的死亡率與硒的地理分布及攝入量呈負(fù)相關(guān),肺癌死亡率與當(dāng)?shù)厝巳貉匠守?fù)相關(guān)[7,8].據(jù)報(bào)道宣威肺癌高發(fā)區(qū)土壤硒的含量低于中國(guó)背景值[9],我們推測(cè)該地區(qū)肺癌高發(fā)可能與低硒有關(guān),為此本研究檢測(cè)了宣威肺癌患者的血清硒含量和肺組織硒水平,以初步探討宣威地區(qū)肺癌高發(fā)與硒的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 血清 2007年1月-2008年12月間云南省腫瘤醫(yī)院胸心外科和胸外科就診的原發(fā)性肺癌患者60例,女性,年齡38歲-70歲,平均52歲,經(jīng)組織和/或細(xì)胞病理檢查確診.2007年1月-2008年12月間云南省宣威市人民醫(yī)院外二科收治的非腫瘤非呼吸道疾病外傷患者60例,女性,年齡35歲-65歲,平均51歲.試驗(yàn)組與對(duì)照組均為女性,年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.444).兩組均在宣威或富源居住2年以上,排除合并糖尿病和肝臟疾病,排除有吸煙史和飲酒史.吸煙史指連續(xù)吸煙超過(guò)6個(gè)月,飲酒史指每周喝酒1次并連續(xù)6個(gè)月以上.簽署知情同意書(shū)后,抽取靜脈血3 mL置于血清管中,離心取血清1 mL,-80oC冰箱保存.

1.1.2 肺組織 2007年1月-2008年12月間云南省腫瘤醫(yī)院胸心外科和胸外科收治的原發(fā)性肺癌患者60例,術(shù)中取新鮮肺癌組織、癌旁肺組織(距癌組織邊緣2 cm的肺組織)、正常肺組織(距癌組織邊緣>5 cm的肺組織).其中宣威地區(qū)患者(指在宣威或富源居住2年以上)31例,年齡38歲-62歲,平均48歲;男性10例,女性21例;腺癌21例,鱗癌10例;I期15例,II期11例,III期5例.非宣威地區(qū)患者29例,年齡40歲-61歲,平均52歲;男性18例,女性11例;腺癌10例,鱗癌19例;I期6例,II期18例,III期5例.宣威地區(qū)和非宣威地區(qū)患者年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,兩組均經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)證實(shí),排除合并其它腫瘤、糖尿病和肝臟疾病.-80oC冰箱保存.

1.2 主要試劑與儀器 硒標(biāo)準(zhǔn)液、質(zhì)控豬肉粉、質(zhì)控小牛血清、DAN試劑、鉬酸鈉、EDTA、濃鹽酸(36%-38%)、氨溶液、環(huán)己烷均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司.熒光光譜儀F-7000購(gòu)自日本Hitachi公司.

1.3 配制試劑 0.1%DAN試劑:在暗室內(nèi)稱(chēng)取DAN 200 mg,加入0.1 mol/L鹽酸200 mL,振搖15 min.加入40 mL環(huán)己烷,振搖5 min,將此液倒入塞有脫脂棉的分液漏斗中,待分層后濾去環(huán)己烷層.純化后的DAN溶液儲(chǔ)于棕色瓶中,加入1 cm厚環(huán)己烷覆蓋表層.置冰箱內(nèi)保存.混合酸液:稱(chēng)取鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)7.5 g溶于150 mL水中.加入過(guò)氯酸(70%-72%)和150 mL去硒硫酸,混勻.EDTA混合液:將A液100 mL、B液10 mL、C液5 mL混合,加水稀釋至1,000 mL.A液(0.2 g/mol EDTA二鈉鹽):稱(chēng)取37 g EDTA加熱至完全溶解,冷卻后稀釋至500 mL.B液(10%鹽酸羥胺溶液):稱(chēng)取10 g鹽酸羥胺溶于水,稀釋至100 mL.C液(0.02%甲酚紅指示劑):稱(chēng)取甲酚紅50 mg溶于少量水中,加12.5%氨水1滴,完全溶解后加水稀釋至250 mL.

1.4 樣品消化 常溫下解凍血清和組織.稱(chēng)取肺癌組織、癌旁肺組織和正常肺組織各0.5 g.將血清及組織分別放入磨口三角瓶?jī)?nèi).加10 mL混合酸液,放置過(guò)夜.于沙浴上加熱,當(dāng)激烈反應(yīng)發(fā)生后溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙出現(xiàn),繼續(xù)加熱至溶液呈現(xiàn)黃色,立即取下,冷卻后溶液仍轉(zhuǎn)為無(wú)色.

1.5 生成并測(cè)定4,5-苯并苤硒腦 消化完畢的溶液中加入20 mL EDTA混合液,混勻后溶液呈深粉紅色,用氨溶液及濃鹽酸調(diào)至略成粉紅橙色,pH1.5-2.0,于冷水中冷卻.以下在暗室內(nèi)操作:加入DAN試劑3 mL,混勻后置沸水浴中加熱5 min.冷卻后,加環(huán)己烷3.0 mL,振搖4 min.將全部溶液移入分液漏斗,待分層后放掉水層,將環(huán)己烷層由分液漏斗上口傾入帶蓋試管中,于原子熒光光譜儀上用激發(fā)光波長(zhǎng)376 nm、放射光波長(zhǎng)520 nm測(cè)定苤硒腦的熒光強(qiáng)度.

1.6 繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精確取標(biāo)準(zhǔn)硒溶液(0.05 μg/mL)0 mL、0.2 mL、1.0 mL、2.0 mL及4.0 mL加去離子水至5 mL后,按樣品步驟同時(shí)進(jìn)行測(cè)定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.7 質(zhì)量控制 正式分析樣品前,分別取質(zhì)控小牛血清和豬肉粉,檢測(cè)標(biāo)樣中的硒含量,以檢驗(yàn)熒光光譜儀的精密度和準(zhǔn)確度.

1.8 計(jì)算 每克樣品中硒含量(μg)=[標(biāo)準(zhǔn)硒含量(μg)/(標(biāo)準(zhǔn)硒熒光讀數(shù)-空白熒光讀數(shù))]X[(樣品熒光讀數(shù)-空白熒光讀數(shù))/樣品重量(g)].

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示.組間差異比較采用單因素方差分析.以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 血清硒水平 試驗(yàn)組血清硒濃度為(55.22±13.34)μg/L,對(duì)照組為(60.33±13.82)μg/L,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041).

2.2 肺組織硒水平 60例肺癌患者的硒含量為肺癌組織低于癌旁肺組織(P<0.05),癌旁肺組織低于正常肺組織(P<0.05),肺癌組織明顯低于正常肺組織(P<0.01)(表1).兩個(gè)地區(qū)肺癌組織、癌旁肺組織和正常肺組織間比較,硒水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,宣威地區(qū)肺癌組織硒含量低于該地區(qū)正常肺組織水平(P<0.05)(表2).腺癌和鱗癌、不同分期的肺癌組織、癌旁肺組織和正常肺組織之間的硒水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

表 1 肺癌患者肺組織硒水平Tab 1 Mean levels of lung tissue Se measurements in lung cancer patients

表 2 宣威地區(qū)和非宣威地區(qū)肺癌患者肺組織硒水平Tab 2 Mean levels of lung tissue Se measurements in lung cancer patients according to different residence from Xuanwei and non-Xuanwei

3 討論

血清硒含量是反映人體近期硒營(yíng)養(yǎng)狀況的良好指標(biāo),受飲食習(xí)慣、年齡、性別等多因素的影響.血清硒在85 μg/L以上被認(rèn)為硒營(yíng)養(yǎng)狀況充足[10].

本研究以宣威女性作為研究對(duì)象,排除了性別、吸煙和飲酒等影響因素后,觀察到宣威女性肺癌患者及非腫瘤非呼吸道疾病患者平均血清硒含量均低于85 μg/L,宣威女性普遍存在硒營(yíng)養(yǎng)不足,究其原因,可能與宣威地區(qū)地處低硒環(huán)境及當(dāng)?shù)鼐用竦纳攀辰Y(jié)構(gòu)有關(guān).宣威肺癌高發(fā)區(qū)土壤總硒含量為(0.202,5±0.099,5)mg/kg,低于中國(guó)正常地區(qū)土壤硒水平(0.302,4 mg/kg)[9],環(huán)境硒通過(guò)食物鏈影響人體硒營(yíng)養(yǎng)狀況.宣威地區(qū)90%以上的人口是農(nóng)民,膳食內(nèi)容以植物性食物為主,絕大多數(shù)為自種自產(chǎn)的大米、玉米和馬鈴薯,較少攝入含硒豐富的食物如海產(chǎn)品等.本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者平均血清硒含量比對(duì)照組低8.47%,提示機(jī)體低血硒狀態(tài)會(huì)增加肺癌的發(fā)生,低硒是導(dǎo)致宣威肺癌高發(fā)的原因或是其結(jié)果需進(jìn)一步探討.

組織硒含量是反映機(jī)體長(zhǎng)期硒負(fù)荷水平的指標(biāo),與血清硒濃度有關(guān).正常成人肺組織硒含量為0.146 μg/g(濕重)[11].本研究對(duì)宣威地區(qū)和非宣威地區(qū)肺癌患者的肺癌組織、癌旁肺組織、正常肺組織硒含量進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),宣威地區(qū)和非宣威地區(qū)肺癌組織硒含量均低于癌旁肺組織和正常肺組織,呈現(xiàn)從低到高的變化趨勢(shì),癌組織有過(guò)度消耗硒的現(xiàn)象.前期研究[12]發(fā)現(xiàn)適宜濃度的硒在體外對(duì)云南宣威女性肺腺癌細(xì)胞系(XWLC-05)具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡的作用,細(xì)胞內(nèi)一定濃度的硒對(duì)維持細(xì)胞正常功能具有一定保護(hù)作用.本研究提示組織細(xì)胞低硒可能是導(dǎo)致癌變的潛在危險(xiǎn)因素.細(xì)胞內(nèi)適宜濃度的硒通過(guò)提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性、清除自由基和過(guò)氧化物、保護(hù)細(xì)胞膜功能、穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等機(jī)制起到抑癌作用[13-15].

宣威地區(qū)肺癌的發(fā)生與低血硒狀態(tài)有關(guān),肺組織細(xì)胞低硒可能是導(dǎo)致癌變的潛在危險(xiǎn)因素.硒作為營(yíng)養(yǎng)促癌因素,其作用機(jī)制還有待于通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)查和營(yíng)養(yǎng)分析等做進(jìn)一步研究.

致謝:衷心地感謝中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院食品與安全所周瑞華老師對(duì)本研究給予的無(wú)私支持!