蔣焱熠 劉一臻 史志周 王博石 商利 徐昕 張盛周 王明榮

肺癌是世界第一大惡性腫瘤,其發(fā)病率及死亡率居高不下,其中80%-85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),預(yù)后較差.盡管臨床術(shù)式和治療方案不斷改進(jìn),但肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移使中晚期NSCLC患者的5年生存率很低.尋找可預(yù)測(cè)NSCLC患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物,可能有助于提高臨床診斷的精準(zhǔn)率,便于提前干預(yù),降低該病的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移.

腫瘤細(xì)胞通過血管等發(fā)生移位是癌癥發(fā)生及轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要途徑.尿激酶型血漿纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator, uPA)是一種重要的蛋白水解酶,可以把纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶.uPA通過降解細(xì)胞外基質(zhì),促使細(xì)胞移動(dòng).文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道uPA蛋白在乳腺癌、宮頸癌和直腸癌等人類惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào).體外研究[4,5]表明uPA在促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用.

內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)是一種強(qiáng)效的縮血管肽和血管平滑肌細(xì)胞有絲分裂原,ET-1通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)細(xì)胞增殖、浸潤以及血管的生成.ET-1蛋白水平在部分惡性腫瘤中是升高的,如膀胱癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、前列腺癌[8]以及NSCLC[9].卵巢癌的研究[10]顯示ET-1能加快卵巢癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,增強(qiáng)腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移.Boldrini等[11]報(bào)道具有高水平ET-1 mRNA的肺癌組織同時(shí)表現(xiàn)ET-1蛋白高表達(dá).

本文通過組織微陣列聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色技術(shù)(tissue microarrays and immunohistochemistry, TMA-IHC)檢測(cè)了155例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中的uPA和ET-1蛋白表達(dá),進(jìn)而分析了與臨床、病理參數(shù)的相關(guān)性,以探討其臨床意義.

1 材料與方法

1.1 材料 共收集2006年7月-2009年7月中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院胸外科肺癌手術(shù)標(biāo)本155例.全部病例均由病理科診斷為NSCLC.其中,鱗癌73例,腺癌82例;男性110例,女性45例;年齡32歲-80歲,中位年齡60歲;腫瘤分期T2、T3、T4期分別為68例、53例和34例,有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各為112例和43例.其中有完整隨訪資料的病例為107例,死亡病例61例,平均隨訪時(shí)間為20個(gè)月(2個(gè)月-44個(gè)月).

1.2 試劑 兔抗人uPA抗體(001098-R/R1,稀釋濃度1:200)、兔抗人ET-1抗體(000202-R/R1,稀釋濃度1:200)購于賽馳公司,PV-9000免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司.

1.3 組織芯片制作 常規(guī)制作標(biāo)本蠟塊、切片.HE染色后經(jīng)病理學(xué)專家復(fù)診、定位標(biāo)記.根據(jù)定位結(jié)果對(duì)石蠟塊進(jìn)行打點(diǎn),每個(gè)病例用穿刺針取三個(gè)標(biāo)記好的癌組織點(diǎn),轉(zhuǎn)移到芯片蠟塊的相對(duì)應(yīng)位置,對(duì)其進(jìn)行切片.

1.4 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟 組織芯片常規(guī)脫蠟水化后,3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min,0.1%枸櫞酸鈉緩沖液中微波修復(fù)20 min,滴加一抗,4oC冰箱過夜,第二天依次加入試劑1和試劑2,在37oC下分別孵育20 min和30 min.DAB染色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡檢.

1.5 結(jié)果判定 以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號(hào),以陽性腫瘤細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度兩方面分別進(jìn)行半定量評(píng)分.染色強(qiáng)度評(píng)價(jià)方法:不著色為0分,淺棕黃色為1分,中度著色為2分,深棕黃色為3分.陽性腫瘤細(xì)胞百分率評(píng)價(jià)方法:無陽性細(xì)胞為0分,陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)1%-33%為1分,陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)34%-67%為2分,陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)達(dá)到67%-100%為3分.染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率得分相加記為綜合分,0分-2分為陰性/弱陽性,3分-5分為中度陽性,6分為強(qiáng)陽性.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),采用雙側(cè)卡方檢驗(yàn)方法分析蛋白表達(dá)改變與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,Kaplan-Meier方法分析蛋白表達(dá)與患者術(shù)后生存之間的關(guān)系.P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 uPA和ET-1在NSCLC組織中的表達(dá)情況 uPA陰性/弱陽性、中度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)在鱗癌中的比例各為12.3%、64.4%和23.3%,在腺癌中分別為12.2%、53.7%、34.1%,在全部病例分別為12.3%、58.7%、29.0%.ET-1在鱗癌中陰性/弱陽性、中度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)分別為2.7%、42.5%、54.8%,在腺癌中各為11.0%、30.5%、58.5%,在全部病例分別為7.1%、36.1%、56.8%(表1,圖1,圖2).

2.2 uPA和ET-1表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性對(duì)uPA、ET-1表達(dá)與腫瘤組織的分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示單個(gè)蛋白在鱗癌的表達(dá)與以上臨床病理參數(shù)均無關(guān).uPA和ET-1同時(shí)高表達(dá)(強(qiáng)陽性)多見于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腺癌中(P=0.017)(表2).

2.3 uPA和ET-1蛋白表達(dá)與NSCLC患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系 經(jīng)Kaplan-Meier分析,ET-1表達(dá)與NSCLC患者術(shù)后生存時(shí)間無關(guān),uPA蛋白高表達(dá)或與ET-1同時(shí)高表達(dá)的腺癌患者具有較長的術(shù)后生存時(shí)間(P=0.007, P=0.016)(圖3,圖4).

表 1 155例NSCLC組織uPA和ET-1表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果Tab 1 The expression of uPA, ET-1 protein in 155 cases of NSCLC by immunohistochemistry

圖 1 uPA在NSCLC中表達(dá)的免疫組化染色Fig 1 The expression of uPA in NSCLC with immunohistochemistry.Left to right: negative/weak, moderate and high expression; A-F:squamous cell carcinoma; G-L: adenocarcinoma.

圖 2 ET-1在NSCLC中表達(dá)的免疫組化染色Fig 2 The expression of ET-1 in NSCLC with immunohistochemistry.Left to right: negative/weak, moderate and high expression; A-F:squamous cell carcinoma; G-L: adenocarcinoma.

3 討論

惡性腫瘤由于其細(xì)胞生長、增殖失控等多因素、多層面的不確定因素,導(dǎo)致目前在臨床上還沒有一個(gè)很好的治療辦法.肺癌是威脅人類健康最主要的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及死亡率均居于癌癥榜首.依靠傳統(tǒng)的肺癌患者預(yù)后指標(biāo)尚難把不同發(fā)病機(jī)制的患者區(qū)分開來.從分子水平尋找一些敏感性、特異性高的NSCLC相關(guān)分子標(biāo)志物,可能為現(xiàn)有的預(yù)后指標(biāo)提供重要補(bǔ)充.

uPA于1976年被Astedt等[12]在卵巢腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn).uPA以無活性的單鏈絲氨酸酶原形式由腫瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞分泌,在細(xì)胞表面與uPAR(uPA的受體)結(jié)合后可被細(xì)胞表面的纖溶酶、舒血管素等激活.促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向受破壞的細(xì)胞外基質(zhì)移動(dòng),引起腫瘤局部浸潤性生長并進(jìn)入脈管系統(tǒng),進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13].本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中存在uPA蛋白高表達(dá),與國內(nèi)外在其它腫瘤中觀察的uPA變化相符.Yang等[14]在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)uPA蛋白升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05),也與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果類似.Konecny等[15]報(bào)道uPA蛋白升高與卵巢癌患者較短的生存時(shí)間相關(guān),而且可能作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后分子標(biāo)志物.而本研究結(jié)果顯示uPA蛋白高表達(dá)的肺腺癌患者卻具有較長的生存時(shí)間,是否uPA在不同癌癥中的作用有所差異,值得進(jìn)一步研究.

表 2 uPA和ET-1在腺癌中高表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 2 The relationship between uPA, ET-1 protein high xepression and clinicopathological parameters of adenocarcinoma

圖3 uPA、ET-1表達(dá)與腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間相關(guān)性的Kaplan-Meier分析Fig 3 The Kaplan-Meier survival curves of adenocarcinoma patients with expressions of uPA and ET-1. A: uPA expression (P=0.007);B: Expression of both uPA and ET-1 (P=0.016).

內(nèi)皮素(ET)家族中有三種異構(gòu)體:ET-1、ET-2和ET-3,三者之間僅有2個(gè)-6個(gè)氨基酸不同,具有組織特異性[16].人的ET-1基因全長12,464 bp,含有5個(gè)外顯子.ET-1是體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管活性肽,廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),在很多腫瘤中都有過度表達(dá).在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中,血管生成是一個(gè)較早期事件.本研究發(fā)現(xiàn)ET-1蛋白在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào),與文獻(xiàn)報(bào)道一致.劉玉春等[9]采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ET-1在NSCLC組織中的表達(dá)高于肺良性病變組織,尤其是在具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的肺癌組織中.我們并沒有觀察到ET-1與NSCLC的任何臨床、病理參數(shù)存在相關(guān)性.但是,本研究的結(jié)果顯示uPA和ET-1同時(shí)高表達(dá)多見于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腺癌中,而且uPA和ET-1同時(shí)高表達(dá)的腺癌患者具有較長的術(shù)后生存時(shí)間.這一結(jié)果也反映了腫瘤發(fā)生發(fā)展中的多基因異常,uPA和ET-1蛋白的聯(lián)合檢測(cè)可能有助于肺腺癌的預(yù)后判斷.