彭婷婷 王衛(wèi)華 菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東省菏澤市 274000

女貞子為木犀科植物女貞（ligustrum lucidumait.）的干燥成熟果實(shí)，味甘、苦，性涼，具有補(bǔ)肝腎陰，烏須明目的功效［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為女貞子可以抑制幽門(mén)螺桿菌的作用可以治療胃病，還具有抑制嘌呤異常代謝用于痛風(fēng)和高尿酸血癥的治療。主要用于治療肝腎陰虛，腰酸耳鳴，須發(fā)早白；眼目昏暗，視物昏暗；陰虛發(fā)熱，胃病及痛風(fēng)和高尿酸血癥［2］。藥理研究表明女貞子中促進(jìn)免疫的主要有效成分為齊墩果酸、熊果酸及乙酰齊墩果酸［3］。齊墩果酸屬五環(huán)三萜類化合物，是一種光譜抗變態(tài)反應(yīng)藥，也是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑［4］。有文獻(xiàn)記載采用薄層色譜法測(cè)定女貞子中齊墩果酸的含量［5］。本文建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定女貞子中齊墩果酸含量，為合理提取女貞子的活性成分及女貞子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（標(biāo)準(zhǔn)二元泵，標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，安捷倫Chem Station工作站），Phenomenix Luna C18柱（4.6×250mm，5μm）；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：TU－1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，Mettler Toledo AL 104電子分析天平；Mettler Toledo 320－S p H計(jì)；微孔濾膜（0.45μm，北洋膜技術(shù)公司），超聲清洗儀（上海之信儀器有限公司），速微型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

1.2 試劑 齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110709－200304）；女貞子購(gòu)自于菏澤市牡丹大藥房，批號(hào)分別為100830，100905，100910，100916，甲醇為色譜純，水為蒸餾水，超純水，其他試劑、試藥均為分析純。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品10mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度1mg／ml的齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.2 齊墩果酸樣品溶液的制備

2.2.1 女貞子中齊墩果酸的提取。取女貞子粗粉2g，放入100圓底燒瓶中，加15%鹽酸20ml，再加三氯甲烷20ml，于70℃水浴加熱回流2h，過(guò)濾，取三氯甲烷提取液回收至糖漿狀，趁熱轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷后成半固體狀。

2.2.2 齊墩果酸的精制。取上述半固狀物，以少量石油醚洗滌，除去脂溶性較大的成分，即有固體析出，抽干得淺黃色析出物。稱重用1∶100倍量（W／V）95%乙醇回流10min，過(guò)濾，濾液濃縮至小體積，放置，析出粗晶，抽濾得齊墩果酸粗品。反復(fù)用95%乙醇重結(jié)晶，得到精制得齊墩果酸固體，經(jīng)稱重為120mg。

2.2.3 齊墩果酸樣品液的制備。取精制所得的齊墩果酸樣品40mg，放入100ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲溶解，過(guò)濾，取濾液10ml放入100ml容量瓶中，再用甲醇稀釋至刻度，即得齊墩果酸樣品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Phenomenix Luna C18柱（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰乙酸（265∶35∶0.1，V／V），流速為0.8ml／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，進(jìn)樣量20μl。取齊墩果酸對(duì)照品溶液和女貞子中提取的齊墩果酸樣品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果樣品溶液和對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有吸收峰，見(jiàn)圖1。

圖1 齊墩果酸高效液相色譜圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 線性關(guān)系的考察 取對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相稀釋得到5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、25μg／ml、40μg／ml、60μg／ml的溶液，然后按照2.3項(xiàng)下的條件進(jìn)樣20μl進(jìn)行測(cè)定，并且各測(cè)定3次，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X）與對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）作回歸處理，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y＝4.895 2X＋0.207 3（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，齊墩果酸對(duì)照品在5～60μg／ml濃度范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積間均呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表1、圖2。

表1 濃度與色譜峰面積關(guān)系

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取20μL齊墩果酸對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，按2.3項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積的平均值為4 922。結(jié)果表明女貞子中齊墩果酸的RSD為1.34%，表明本法精密度良好，見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取女貞子藥材粉末2g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，分別于0、2、4、8、12、24h分別精密吸取20μL，測(cè)定峰面積值，得峰面積平均值147.5，RSD＝1.93%（n＝6），可見(jiàn)供試品溶液在24h內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱取同一批女貞子粉末6份，按2.2項(xiàng)下方法，制備供試液，分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行定量測(cè)定，得峰面積平均值145.4，其RSD值為0.95%，表明利用本法測(cè)定女貞子中齊墩果酸的含量、方法重現(xiàn)性良好。

3.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的女貞子粗粉9份，分別加入25μg／ml對(duì)照品溶液1ml，2ml，3ml，按2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液20μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行定量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果女貞子齊墩果酸的平均加樣回收率為100.64%，RSD為1.46%。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

3.6 樣品測(cè)定 分別取上述女貞子藥材樣品，按2.2項(xiàng)下方法，制備供試液，分別精密吸取20L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件，分別測(cè)定樣品中齊墩果酸的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 女貞子中齊墩果酸的含量（%）

4 討論

（1）測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：采用紫外分光光度計(jì)在190～380nm范圍內(nèi)分別掃描齊墩果酸對(duì)照品、供試品溶液中齊墩果酸峰的紫外吸收，對(duì)照品和供試品中的齊墩果酸均在210nm有最大吸收，故選用210nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。（2）女貞子中齊墩果酸的提取：根據(jù)女貞子中齊墩果酸以游離型和結(jié)合成苷的形式共存于果實(shí)中，采用兩相溶劑水解法［6］提取女貞子中的齊墩果酸。即讓女貞子中的齊墩果酸苷在鹽酸水溶液中水解，同時(shí)在反應(yīng)混合物中加入與水不相混溶的有機(jī)溶劑（如苯、三氯甲烷），使水解后的齊墩果酸苷元即刻進(jìn)入有機(jī)相，可避免苷元長(zhǎng)時(shí)間和酸接觸，從而得到原始的苷元。（3）由表4可以看出，100830、100905、100910、100916批次的女貞子中齊墩果酸的含量分別為5.75%，4.93%，4.14%，3.85%，隨著采收日期的推遲，女貞子中齊墩果酸的含量呈下降趨勢(shì)，符合文獻(xiàn)中對(duì)于女貞子中齊墩果酸的含量的描述。文獻(xiàn)記載［7］，女貞子中齊墩果酸的含量以幼果期（8月份）含量最高，可達(dá)8.04%，隨著發(fā)育成熟下降到2.5%左右。（4）本文是首次采用高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定女貞子中齊墩果酸的含量。有文獻(xiàn)［8］記載采用薄層色譜法測(cè)定女貞子中齊墩果酸的含量。與薄層色譜法相比，高效液相色譜外標(biāo)法靈敏度更高，專屬性更強(qiáng)，結(jié)果更準(zhǔn)確，而且適合大量樣品的分析。本方法的線性回歸曲線方程為：Y＝4.895 2X＋0.207 3，r＝0.999 8（n＝6），在5～60μg／ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，符合利用外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算的要求。本方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均符合要求。此外，本方法的平均加樣回收率為100.64%，RSD%為1.46%，表明方法的準(zhǔn)確度符合定量分析方法的要求。

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