都書琪，吳偉力，張騫，孔垂?jié)?/p>

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110001）

膀胱中尿液的逐漸蓄積是一種伸展性質(zhì)的刺激，它會被轉(zhuǎn)化為傳入神經(jīng)的電活動，最終觸發(fā)排尿反射［1］。在有下尿路癥狀的疾病中，例如膀胱炎癥、膀胱過度活動癥等，儲尿期癥狀是困擾患者的主要問題，例如尿頻、尿急、急迫性尿失禁等。其中一個可能的發(fā)病機制是膀胱傳入神經(jīng)通路活動的增強，所以膀胱的感覺傳導(dǎo)機制是一個重要問題。膀胱黏膜中存在機械敏感性分子，受到伸展刺激后，會引起腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP）等釋放，ATP會進(jìn)一步激活黏膜下層感覺神經(jīng)末梢上的P2X受體，從而將膀胱容量改變的信號傳遞到排尿中樞［2，3］。另外，膀胱感覺神經(jīng)末梢本身也有機械敏感性受體的表達(dá)，可能在生理或者病理狀態(tài)下參與膀胱感覺傳導(dǎo)。

瞬時受體電位蛋白通道A1（transient receptor potential channel A1，TRPA1）是哺乳動物體內(nèi)機械敏感性分子的候選者，它還參與疼痛的感覺傳導(dǎo)，并且與炎性反應(yīng)相關(guān)［4～6］。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)膀胱黏膜上皮細(xì)胞和脊髓后根神經(jīng)節(jié)中支配膀胱的初級感覺神經(jīng)元都表達(dá)TRPA1［7］，人的梗阻性膀胱上皮中TRPA1的表達(dá)升高［8］，所以TRPA1可能在黏膜層和感覺神經(jīng)元兩個部位參與膀胱的感覺傳導(dǎo)。膀胱內(nèi)灌注TRPA1的受體激動劑引起排尿反射亢進(jìn)［7］，提示它可能在病理狀態(tài)下的排尿改變中發(fā)揮作用。我們制作了大鼠的膀胱炎癥模型，并檢測膀胱黏膜層以及脊髓后根神經(jīng)節(jié)兩個部位TRPA1的表達(dá)水平是否有改變，以求闡明哪一個部位的TRPA1與膀胱炎癥以及炎癥狀態(tài)下的排尿改變之間存在可能的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

18周齡的雌性SD大鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)動物部，體質(zhì)量210 g。環(huán)磷酰胺及烏拉坦購自Sigma公司。RNA提取試劑盒 RNEASY Mini Kit、DNase I、RNAlater購自Qiagen公司。逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR采用的PrimeScript RT reagent Kit試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 動物處理

實驗組采用5只大鼠，腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺（300 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水中）。注射48 h后烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，先迅速摘除膀胱，將其剖開后，取一小塊全層組織置于OCT膠中包埋，以備HE染色用，將其余膀胱組織立即浸泡于RNAlater中；縫合腹部切口后自后背腰骶部縱行切開，去除脊柱棘突及椎板，于實體顯微鏡下，采用顯微外科器械，摘除L6S1節(jié)段的脊髓后根神經(jīng)節(jié)，固定于RNAlater中；處死大鼠后，于實體顯微鏡下，將已經(jīng)浸泡于RNAlater中的膀胱黏膜層從肌層上分離下來，分離過程中盡量減少肌層混入黏膜層中。對照組5只大鼠腹腔內(nèi)注射1 mL生理鹽水，其余操作與實驗組動物相同。浸泡于RNAlater中的標(biāo)本4℃過夜后-20℃保存。

1.3 提取mRNA及逆轉(zhuǎn)錄

膀胱黏膜層和脊髓后根神經(jīng)節(jié)中的mRNA采用試劑盒推薦的操作步驟提取。RNA中殘留的基因組DNA采用DNase I消化，以避免在后面的PCR反應(yīng)中基因組DNA的擴(kuò)增干擾結(jié)果。測定RNA濃度后，2～8 μL RNA加入20 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用隨機六聚體引物，反應(yīng)條件：42℃20 min。

1.4 定量PCR

2 μL cDNA加入25 μL的定量PCR反應(yīng)體系中。TRPA1的引物序列F：5′-CTCAGGTTCAATGTG TCCGTTC-3′；R：5′-GTGCTGTGTTCCCTTCTTCATC-3′［7］。我們選用 β-actin 作為內(nèi)部對照，其引物序列F：5′-TGTGTTGTCCCTGTATGCCT-3′；R：5′-TAATGTC ACGCACGATTTCC-3′［7］。TRPA1 的反應(yīng)條件：95 ℃15 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s變性，65℃ 20 s退火及延伸，82.5℃7 s檢測熒光信號，共40個循環(huán)；溶解曲線分析。β-actin的反應(yīng)條件是：95℃15 s，1個循環(huán)；95℃5 s變性，55℃20 s退火，72℃20 s延伸及檢測，共40個循環(huán)；溶解曲線分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 膀胱炎癥

腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺48 h后摘除膀胱時，肉眼可以見到膀胱充血、水腫，HE染色證實膀胱的炎性改變。

2.2 顯微操作及PCR的定性分析

摘除大鼠的L6S1脊髓后根神經(jīng)節(jié)，并把膀胱黏膜層從肌層上分離出來。膀胱黏膜層及脊髓后根神經(jīng)節(jié)都表達(dá)TRPA1（圖1）。定量PCR反應(yīng)中的溶解曲線分析提示，在所有的反應(yīng)體系中，均沒有非特異性條帶出現(xiàn)。反應(yīng)產(chǎn)物電泳于358 bp見到TRPA1目的條帶，也未見到非特異性產(chǎn)物（圖1）。

2.3 定量分析

TRPA1的表達(dá)量采用管家基因β-actin作為內(nèi)參標(biāo)化（TRPA1/β-actin）。在黏膜層，對照組和炎癥組的表達(dá)水平分別是0.032 9±0.016 2及0.125±0.096 5，兩者之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。在脊髓后根神經(jīng)節(jié)，TRPA1的表達(dá)水平明顯高于黏膜層。對照組和炎癥組的表達(dá)水平分別是0.915±0.289及 1.905±0.777（P<0.05）（圖 3）。

3 討論

TRPA1是哺乳動物體內(nèi)機械敏感性受體的候選者，我們的前期工作發(fā)現(xiàn)膀胱黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)TRPA1［7，8］，TRPA1 的通道性質(zhì)類似于機械感受器中的通道性質(zhì)［4］。近年來研究者發(fā)現(xiàn)膀胱黏膜不單純的是尿液和血液之間的一個屏障，它還能感知尿液蓄積的伸展刺激，并釋放多種生物活性物質(zhì)，例如ATP［2，3］，進(jìn)而興奮黏膜下層的感覺神經(jīng)末梢。我們設(shè)想膀胱黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的TRPA1起到機械感受器的作用，將伸展刺激與傳入神經(jīng)沖動聯(lián)系起來［8］。

環(huán)磷酰胺被注射到腹腔后，其代謝產(chǎn)物通過腎臟排泄，刺激膀胱，產(chǎn)生炎性反應(yīng)。這是一個排尿研究領(lǐng)域常用的炎性模型。我們在注射環(huán)磷酰胺48 h后觀察到膀胱明顯充血水腫，HE染色證實膀胱存在炎性反應(yīng)。炎癥狀態(tài)下，大鼠膀胱的儲尿期表現(xiàn)出排尿間隔縮短，排尿次數(shù)增加等反射亢進(jìn)的癥狀。我們設(shè)想炎癥可能誘導(dǎo)TRPA1在黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)，從而間接增強膀胱傳入神經(jīng)通路的興奮性。本實驗中炎性組黏膜層表達(dá)TRPA1較對照組略高，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示黏膜上皮細(xì)胞中的TRPA1可能不是作為機械敏感性分子發(fā)揮作用的，或者說在環(huán)磷酰胺誘發(fā)炎癥的情況下，黏膜層的TRPA1與排尿方式的改變沒有確切關(guān)系。

我們前期發(fā)現(xiàn)支配膀胱的初級感覺神經(jīng)元中有半數(shù)表達(dá) TRPA1［7］，提示在黏膜層外，TRPA1 可能在神經(jīng)末梢發(fā)揮重要作用。在本實驗中，我們利用顯微外科技術(shù)成功摘除脊髓后根神經(jīng)節(jié)，其中TRPA1的表達(dá)量是黏膜層的27倍，說明感覺神經(jīng)中的TRPA1要比黏膜層中的TRPA1發(fā)揮更多或更重要的作用。

除了是機械敏感性受體的候選者之外，TRPA1還參與痛覺傳導(dǎo)，并且參與炎性反應(yīng)，此外，也有部分研究支持它是寒冷刺激的受體［6］。在炎性條件下，脊髓后根神經(jīng)節(jié)中TRPA1的表達(dá)水平比對照組升高，并且有統(tǒng)計學(xué)意義。TRPA1的表達(dá)上調(diào)能使膀胱傳入神經(jīng)興奮性增強，排尿反射亢進(jìn)，從而發(fā)生尿頻、尿急等。另外，TRPA1還可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢釋放炎性介質(zhì)，參與膀胱內(nèi)的炎性反應(yīng)［6］。

我們的結(jié)果提示在大鼠膀胱中，黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的TRPA1可能不參與炎性條件下的排尿改變，其作為機械敏感性受體發(fā)揮作用的可能性較小。脊髓后根神經(jīng)節(jié)中TRPA1的表達(dá)量比黏膜層明顯升高，并在炎性條件下，其表達(dá)量較對照組增加，它可能參與炎癥反應(yīng)，興奮膀胱傳入通路，改變排尿方式。初級感覺神經(jīng)元的TRPA1可能參與病理條件下膀胱反射的調(diào)節(jié)，它可能是病理性排尿方式的治療靶點。

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