劉梯樓，孫雙姣

（邵陽醫(yī)學高等?？茖W校，湖南 邵陽 422000）

牛初乳中免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）能夠與病原微生物及毒素等抗原結合，形成抗體，同時促進哺乳動物新生幼仔自身免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，保護其免受病原侵襲。因此，IgG的含量是評價牛初乳制品品質的一個重要指標[1]，它的測定在牛初乳產品檢驗中具有重要意義。牛初乳IgG含量主要檢測方法有瓊脂免疫單擴散法[2]、瓊脂免疫雙擴散法[3]、高效液相色譜法[4]、免疫比濁法[5]，免疫共振散射法[6]等。其中，瓊脂免疫單、雙擴散法檢測時間長、測定誤差大、檢測結果滯后；高效液相色譜儀器色譜要求較高；免疫比濁法靈敏度較低，檢測限為70 μg/mL[5]。共振散射光譜分析具有靈敏度高和簡便快速等特點[7-8]，但由于免疫復合物具有一定的水溶性，共振散射強度較弱，直接利用免疫復合物微粒的共振散射來測定IgG，靈敏度只提高為1.1μg/mL[6]。 膠體金標記技術因具有簡單、快速、準確、無污染等特點，已成為第四大免疫標記新技術[9]。已知金納米微粒粒徑較小時，共振散射強度較弱，當其粒徑增大時，共振散射強度明顯增大[10]，但共振散射峰的位置不發(fā)生變化[11]。羊抗牛IgG與牛IgG的反應具有較高的選擇性，生成的免疫復合物的共振散射較弱，直接來測定IgG的靈敏度較低。金溶膠的光散射與金顆粒的大小密切相關，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變化[12]。在金標羊抗牛IgG體系中，羊抗牛IgG分子牢固地結合在金顆粒的表面，當牛IgG與羊抗牛IgG發(fā)生特異性反應后，適當粒徑的金顆粒裸露出來，聚集形成了較大的金顆粒導致體系的共振散射增強。牛IgG在一定濃度范圍內隨著其濃度的增加，釋放的金顆粒越多，金顆粒聚集的程度越強，共振散射強度線性增強，據(jù)此可建立IgG的免疫共振散射光譜分析法。本文將牛IgG抗體用金納米標記后，在一定條件下IgG抗體與IgG發(fā)生免疫發(fā)應，導致金納米發(fā)生聚集，通過測其580 nm處共振散射強度變化，可以間接地測定IgG的濃度，由于IgG的濃度是通過金納米的共振散射間接表達出來的，所以極大地提高了檢測的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

HAuCl4（國藥集團化學試劑公司），牛IgG（上海午立生物技術公司），羊抗牛IgG（上海午立生物技術公司），Tris-HCl緩沖溶液，聚已二醇20000（PEG-20000），質量濃度分別為1.00%與10.00%的檸檬三鈉和 KCl溶液，0.20 mol/L的K2CO3，0.10 mol/L的HCl，所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

RF-540型熒光分光光度計（日本島津）；79-1磁力加熱攪拌器（江蘇中大儀器廠）；SK8200LH超聲波反應器（上?？茖С晝x器有限公司）；H-600型透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 方法

1.2.1 膠體金標羊抗牛IgG的制備 （1）金溶膠的制備與鑒定。膠體金由檸檬酸鈉改良法[13]制備，并用透射電鏡進行表征。（2）羊抗牛IgG在標記前用透析袋放置在含0.005%NaCl的二次蒸餾水中透析30 h，以除去多余的電解質。（3）確定納米金標記羊抗牛IgG的最佳pH值。利用共振散射方法試驗了不同pH對于膠體金標記的影響：將膠體金調節(jié)至不同的pH值后各取1 mL加入25 μg羊抗牛IgG，混勻，放置5 min，加入0.1 mL 10%KCl，混勻后放置2 h，稀釋至3 mL，測580 nm處的共振散射強度（儀器參數(shù)：低靈敏檔，縱坐標為6）。（4）膠體金與待標羊抗牛IgG用量比的確定。分別取羊抗牛 IgG 5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg 加到1 mL pH為8.5的膠體金溶液中，另取一管不加羊抗牛IgG為對照管，混勻，5 min后均加入0.1 mL10%KCl溶液，混勻后靜置2 h，稀釋至3 mL，取適量測定各管580 nm處的共振散射強度（儀器參數(shù)：低靈敏檔，縱坐標為6）。（4）膠體金與待標羊抗牛IgG用量比的確定。分別取羊抗牛IgG 5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg 加到 1 mL pH為8.5的膠體金溶液中，另取一管不加羊抗牛IgG為對照管，混勻，5 min后均加入0.1 mL 10%KCl溶液，混勻后靜置2 h，稀釋至3 mL，取適量測定各管580 nm處的共振散射強度（儀器參數(shù)：低靈敏檔，縱坐標為6）。（5）金標記羊抗牛IgG的制備。用0.2 mol/L的K2CO3，0.1 mol/L的HCl和精密pH試紙將3.0 mg羊抗牛IgG溶液的pH值調至8.5；100 mL的膠體金溶液的pH值也調至8.5。在磁力攪拌下，將調好pH值的羊抗牛IgG溶液加入到100 mL的膠體金中，控制滴加時間為5 min，然后再加入1.75 mL 3%的PEG-20000作為穩(wěn)定劑[12]，攪拌15 min，放置4℃保存。

1.2.2 金標羊抗牛IgG免疫共振散射光譜法測定依次移取0.50 mL pH值為7.0的Tris-HCl緩沖溶液，0.3 mL的金標羊抗牛IgG溶液，一定量牛IgG溶液，0.50 mL 300 mg/mL PEG-20000于10 mL刻度試管中，用蒸餾水定容至3 mL，混勻，室溫下在59KHZ超聲波反應器中溫浴25 min。取適量移入石英池中，置熒光分光光度計上，用低靈敏檔，縱坐標為6，同步掃描激發(fā)波長λex和發(fā)射波長λem（λex＝λem），得到體系的共振散射光譜，測定580 nm波長處的共振散射光強度IRS。不加牛IgG作空白，測其共振散射光強度（IRS）b，計算△I＝IRS－（IRS）b。

1.2.3 樣品及回收率的測定 設4個處理，處理1和處理2為牛初乳粉，處理3為牛初乳咀嚼片，處理4為牛初乳復合膠囊。準確稱取各種牛初乳制品0.0100 g，用pH 7.0的 Tris-HCl緩沖液配制成0.100 mg/mL的樣品溶液，搖勻。12000 r/min離心30 min，取上層清液，經0.45 μm微孔濾膜過濾后，取50 μL，按1.2.2方法進行樣品測定。對4種含不同濃度的樣品，分別加入IgG標準液后測定IgG的含量，并計算回收率。

2 結果與分析

2.1 膠體金標羊抗牛IgG的制備

2.1.1 金溶膠的制備與鑒定 如圖1所示，金納米粒徑均勻，平均大約為9 nm，且分散性好。

2.1.2 納米金標記羊抗牛IgG的最佳pH值的確定 由表1可以看出，當pH值小于8.5時，所加的羊抗牛IgG不能穩(wěn)定膠體金，加入KCl溶液后（因用檸檬酸納改良法制備的膠體金加NaCl后不會發(fā)生聚集），金溶膠發(fā)生了聚集，共振散射強度較大；當pH值為8.5時，由于蛋白質包裹了膠體金。KCl溶液不能使被包裹的膠體金聚集，體系具有最小的共振散射強度。因此，實驗選擇將膠體金用0.2 mol/L的K2CO3，0.1 mol/L的HCl調節(jié)至pH值為8.5。

表1 不同pH值對于膠體金標記的影響

2.1.3 膠體金與待標羊抗牛IgG用量比的確定由表2可以看出，對照管和加入羊抗牛IgG的量為5～25 μg的各管共振散射強度較大，而加入羊抗牛IgG為30～50 μg的各管共振散射強度較小且維持穩(wěn)定，因此，30 μg為穩(wěn)定1 mL膠體金溶液的最低羊抗牛IgG用量，也就是金標記羊抗牛IgG的最低用量。選取30 μg為實際的羊抗牛IgG的用量，標記100 mL的金溶膠加入量為3.0 mg。

表2 不同羊抗牛IgG對于膠體金標記的影響

2.2 共振散射光譜

金標記羊抗牛IgG在340，470，580 nm處有3個共振散射峰（圖2），但共振散射強度較弱，隨著牛IgG的加入，共振散射強度逐漸加強，體系在580 nm處的共振散射峰增強尤為明顯。實驗選取波長為580 nm進行測定。

2.3 共振散射光譜法實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值、緩沖溶液種類及用量的選擇 實驗考察了體系pH（6～8.5）對△IRS的影響。研究表明，隨著體系pH的增加，IRS、（IRS）b都增強。當pH值為7.0時，△IRS相對較大。實驗選取pH值為7.0。用3種不同pH值為7.0的緩沖溶液（Tris-HCl，Na2HPO4-NaH2PO4，巴比妥鈉-HCl）進行實驗，結果表明，Tris-HCl緩沖溶液的靈敏度最高，Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的效果最差。本實驗選取的緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液。研究表明，當Tris-HCl緩沖溶液的用量為0.5 mL時，△IRS有最大值。本實驗選取緩沖溶液的用量為0.5 mL。

2.3.2 不同分子量聚乙二醇濃度的影響 聚乙二醇（PEG）用于免疫復合物的測定[14]。當膠體金的濃度較低時，較高濃度的PEG可以促使膠體金聚集，使膠體金的共振散射特征峰強度明顯增強。研究了PEG-4000、PEG-6000、PEG-10000、PEG-20000 用量對于△IRS的影響，如圖3所示（0.3 mL金標羊抗牛IgG-0.5 mLpH 7.0 Tris-HCl緩沖液-0.266 μg/mL牛IgG-PEG），幾種PEG在一定程度上對△IRS具有增敏作用，其中PEG-20000的為50 mg/mL時，其△IRS具有最大值，故實驗選取50 mg/mL的PEG-20000。

2.3.3 金標羊抗牛IgG用量的影響 考察了金標羊抗牛IgG用量對△IRS的影響，結果（圖4）表明，當金標羊抗牛IgG用量為0.3 mL時，體系的△IRS最大，本文選取的金標羊抗牛IgG用量為0.3 mL。

圖4 金標羊抗牛IgG體積用量的影響

2.3.4 溫度與時間的影響 在37℃水浴條件下，反應能較快地進行，明顯地縮短反應時間，結果比較穩(wěn)定。在室溫（25℃）條件下，反應時間相對較長，且溫度易受氣候的影響，結果不太穩(wěn)定。本實驗選擇了在37℃水浴條件下進行，考察了反應時間（0～60 min）對△IRS的影響。結果表明，當反應時間為25 min時，反應已進行完全，△IRS值趨于穩(wěn)定，本實驗選擇反應時間為25 min.。

2.4 線性關系

在最佳實驗條件下，分別取不同濃度牛IgG標準液，按1.2.2方法進行測定，并以其共振散射強度△IRS與牛IgG濃度ρ作圖。牛IgG濃度在0.0133～1.33 μg/mL范圍內與△IRS之間存在良好的線性關系?；貧w方程為△IRS=117.54 ρ+1.2293，相關系數(shù)為 0.9968，檢出限為 0.00795 μg/mL。

2.5 共存物質的影響

免疫反應具有特異性，干擾其測定的物質較少。按1.2.2方法考察了一些蛋白質對測定0.266μg/mL牛IgG的影響。結果表明，當相對誤差在5%的范圍之內，200 μg/mL的人免疫球蛋白，500 μg/mL 的人血清白蛋白，200 μg/mL 的鼠 IgG，1200 μg/mL的牛血清白蛋白不干擾測定，由此可見，本法具有較高的選擇性。

2.6 樣品及回收率的測定

如表4所示，分別測定了4個樣品中牛IgG的濃度，連續(xù)做5個平行樣，樣品溶液濃度的RSD的范圍為：1.37%～2.30%，測定的重復性良好。

表4 樣品分析

由表5可知，該方法測定IgG的回收率為98.03%～103.28%。

表5 回收率的測定

3 討論與結論

液相金納米微粒具有一系列特殊的物理化學性質，在生物探針、光譜分析和電化學分析中得到了應用。本研究將液相金納米微粒的共振散射效應與免疫反應有機地結合起來，建立了一個測定牛初乳IgG的免疫共振散射光譜分析新方法。通過對4個樣品的測定，方法的重現(xiàn)性好，回收率收率為98.03%～103.28%，由此可見，該法具有較高的靈敏度和選擇性，可應用于試樣分析。

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