河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院 王海鳳 郭 兵

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)定州中獸醫(yī)學(xué)院 許 麗 劉榮欣

皂苷是由皂苷元和糖結(jié)合而成的一類化合物，具有明顯的促進(jìn)血清、肝臟、骨髓等的核糖核酸、去氧核糖核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖等的生物合成作用，還具有祛風(fēng)濕、解熱、抗菌消炎、促腎上腺激素樣作用。研究表明，黃芪皂甙能顯著或極顯著促進(jìn)刀豆蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖，能極顯著或顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞活性（儲岳峰等，2004）。 人參皂苷（GS）可使小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞對ConA及LPS分裂原的反應(yīng)性增強(qiáng)，且與濃度相關(guān)（曹俊嶺等，2008）。本研究旨在通過GS對免疫抑制小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+/CD8+）以及血清 TNF-α 含量的影響，探討其對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 體重22～25 g的昆明雄性健康小鼠（購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心），常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食和飲水，每日光照時(shí)間12 h。適應(yīng)環(huán)境1周后，經(jīng)臨床觀察健康者，進(jìn)行分組。

1.2 中藥 試驗(yàn)用人參皂苷購自陜西匯生醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 試劑及主要儀器 小鼠CD4-FITC和CD8-PE單克隆抗體 （美國Pharmingen公司產(chǎn)品），小鼠TNF-α ELISA試劑盒 （美國BIOSOURCE公司產(chǎn)品）均由北京晶美公司提供。EPICS-XLII型流式細(xì)胞儀 （美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)）；318MC型酶標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司）。

1.4 動物分組及處理 取預(yù)備飼養(yǎng)的小鼠50只，隨機(jī)平均分為5組，空白對照組，每只灌服生理鹽水0.5 mL；第2組環(huán)磷酰氨（CY）模型組，每只灌服生理鹽水0.5 mL，連續(xù)15 d，于灌服第4天腹腔注射 CY（75 mg/kg·BW）連續(xù) 6 d。第 3、4、5組分別為GS低、中、高劑量組，分別灌服GS 0.1、0.5 mL/d和 1 mL/d，連續(xù) 15 d，于灌服第 4天腹腔注射 CY（75 mg/kg·BW）連續(xù) 6 d，于第 16 天處死小鼠。

將小鼠眼球采血，一份用于分離血清，-80℃保存，ELISA試劑盒檢測TNF-α含量；另一份用肝素抗凝（50 U/mL），分為 2 管，每管 0.1 mL，分別加入小鼠CD4-FITC單抗和CD8-PE單抗，充分混合，室溫下避光孵育45 min，用細(xì)胞洗液洗滌2次，1000 r/min離心2 min，棄上清液，加稀釋的熒光標(biāo)記抗體0.1 mL，室溫下避光孵育45 min，洗1次，棄上清液，余約0.5 mL細(xì)胞懸液，加固定液50 μL。以上操作在室溫下進(jìn)行，然后在EPICS-XLII型流式細(xì)胞儀上測定，用Exp32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 11.0系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 GS對免疫抑制小鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群的影響 結(jié)果見表1。CY腹腔注射可極顯著低降低小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例 （P＜0.01）。當(dāng)連續(xù)灌服GS后，各個(gè)劑量均使模型小鼠的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例顯著回升 （P＜0.01或P＜0.05），且均回升至正常水平。其中，CY＋GS低劑量組的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例回升較明顯，顯著高于對照組（P＜0.05）。CY腹腔注射對正常小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例無顯著影響 （P＞0.05）。當(dāng)用CY造模后，再連續(xù)灌服GS，中劑量可使模型小鼠的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例顯著升高 （P＜0.01或P＜0.05）。不同劑量GS對CY免疫抑制小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+的比例有不同的影響作用，其中低劑量可顯著升高模型小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群 CD4+/CD8+的比例（P ＜ 0.05）。

表1 GS對免疫抑制小鼠CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的影響

2.2 GS對小鼠血清TNF-α含量的影響 見表2。由表2結(jié)果可以看出，腹腔注射CY可顯著低降低小鼠TNF-α含量（P＜0.01）。當(dāng)連續(xù)灌服GS后，各個(gè)劑量均使模型小鼠的TNF-α含量得以顯著回升（P＜0.01或P＜0.05）。其中，GS低劑量和中劑量均可顯著提高小鼠的血清TNF-α的含量（P＜0.05）。 高劑量組雖然較CY模型組有所回升，但與空白對照組相比仍較低。

表2 GS對免疫抑制小鼠血清TNF-α含量的影響pg/mL

3 分析與討論

3.1 GS對小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群 （CD4＋/CD8+）的影響 T細(xì)胞是一異質(zhì)性的群體，按其表型和功能的不同，可分為若干亞群，其中輔助型T細(xì)胞（TH）與抑制型T細(xì)胞（TS）是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。檢查TH和TS亞群的百分率及二者的比值，有助于了解機(jī)體的免疫狀態(tài)。CD4+和CD8+分別存在于Ti/TH和Ts/Tc表面，只有表達(dá)CD4+和CD8+分子才表明T細(xì)胞進(jìn)入成熟階段。應(yīng)用免疫熒光染色法，在FC上計(jì)數(shù)CD4+和CD8+的百分率，可間接反映出TH及Ts的百分率 （Lodon和Lanier，2005；Cormary 等 2004）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)用CY造模時(shí)，小鼠的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例極顯著降低（P＜0.01），而CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例無顯著變化 （P＞0.05），表明CY對小鼠的免疫抑制是通過降低TH細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)小鼠處于免疫抑制狀態(tài)時(shí)，GS可提高小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例，但與劑量有關(guān)。其中GS低劑量可顯著升高小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+的比例（P＜0.01或P＜0.05）。由此推斷，GS對小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例的提高作用與GS濃度有關(guān)，且有一個(gè)最適濃度區(qū)域，過高或過低均會造成影響作用下降。分析中、高劑量GS有效成分的濃度可能超出最適濃度區(qū)域，所以對CD4+/CD8+的影響不顯著。

何莉等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液連續(xù)應(yīng)用第14天時(shí)，使缺氧缺血性腦病新生兒外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+恢復(fù)正常。孝巖等（2005）通過試驗(yàn)觀察黃芪、川芎等中藥對慢性肺心病患者免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺心病患者治療前CD3+、CD4+水平顯著低于正常對照組，CD8+高于對照組（P＜0.01），治療后 4、8周 T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)雖未達(dá)到正常水平，但治療前后對比差異顯著（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01），8 周時(shí) CD3+、CD4+中藥組明顯高于對照組。表明黃芪對肺心病患者的細(xì)胞免疫有增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用。楊鳳華等（2003、2002）研究表明，黃芪水溶性黃酮（AF）在適宜的劑量范圍能提高CY致免疫功能低下小鼠脾臟的T細(xì)胞總數(shù)及L3T4+、Lyt2+細(xì)胞百分率和 L3T4+/Lyt2+比值，使之恢復(fù)至正常水平，且存在一定的量效關(guān)系，最適量為1.50 mg/mL，但高濃度反而抑制。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果有相似之處。

3.2 GS對小鼠血清TNF-α含量的影響 TNF-

α主要由巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起著重要作用。T細(xì)胞和NK細(xì)胞在某些刺激因子（如PHA）作用下，也分泌TNF-α。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GS低劑量和中劑量均可顯著提高免疫抑制小鼠血清TNF-α的含量（P＜0.05）。高劑量組雖然較CY模型組有所回升，但與空白對照組相比仍較低。這表明GS對免疫抑制小鼠血清TNF-α含量的提高作用與其濃度有關(guān)，且有一個(gè)最適濃度區(qū)域，過高或過低均會造成影響作用下降。

上述影響作用與GS對免疫抑制小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的影響基本一致。前人的研究結(jié)果也為上述推測提供了依據(jù)。蔣春明等（2005）通過在透析液中添加黃芪注射液可提高巨噬細(xì)胞的活性，增加巨噬細(xì)胞吞噬功能和TNF-α、NO分泌能力，從而增強(qiáng)腹腔局部免疫防御功能。黃芪皂苷甲（ASI）可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面Fc受體增加。研究表明，ASI和綿毛黃芪苷在適當(dāng)濃度下均能促進(jìn)巨噬細(xì)胞Fc受體表達(dá)，增加吞噬指數(shù)，延長巨噬細(xì)胞體外存活時(shí)間，并使LPS誘生TNF的強(qiáng)度增加 4～5倍（張文華等，1996）。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷對免疫抑制小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例以及小鼠血清TNF-α的含量均有一定的促進(jìn)和提高作用。

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