張蕊 周博 李賢宇 （天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院 天津300402）

蝦青素的化學(xué)名稱為3,3'-二羥基-4,4'-二酮基-β,β'-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4（見圖1），相對分子量為596.86，是一種天然非維生素A原的類胡蘿卜素，廣泛存在于蝦蟹、鮭魚和某些藻類及真菌中，常用作魚蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的飼料添加劑。[1]動物實(shí)驗(yàn)表明蝦青素有抑制腫瘤發(fā)生、增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老等多方面的功能，在功能食品、飼料、化妝品和醫(yī)藥等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。[2-4]

圖1 蝦青素的結(jié)構(gòu)式

紅法夫酵母可以發(fā)酵糖類產(chǎn)生蝦青素，最初于1970年在美國阿拉斯加的高山和日本北海道一帶山區(qū)落葉松的滲出液中分離得到。紅法夫酵母有生長速度快、容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)以及提取色素后的酵母細(xì)胞可以作為飼料添加劑等優(yōu)點(diǎn)，已越來越受到人們的重視。但紅法夫酵母的野生型胞內(nèi)蝦青素含量比較低，一般為0.05%細(xì)胞干重，要進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn)最終實(shí)現(xiàn)較高的經(jīng)濟(jì)效益，必須對紅法夫酵母原始菌株進(jìn)行改造，以達(dá)到增產(chǎn)的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 菌種 紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma），中科院微生物所提供，編號As2.1557。

1.1.2 培養(yǎng)基 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基比例：葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，pH值自然。

1.1.3 主要儀器 紫外誘變箱（自制），高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜（上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司），高效液相色譜儀（美國Laballiance公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外誘變 ①菌體前培養(yǎng)[5]：取活化后斜面種子1環(huán)接至盛有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。然后取培養(yǎng)液5 mL接至盛有50 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞處于對數(shù)期后期。②誘變處理：取5 mL菌液于Ф75 cm的培養(yǎng)皿中（帶磁棒），置于紫外誘變箱的磁力攪拌器上，開啟磁力攪拌器，打開皿蓋，分別照射 5 s、10 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s。移取不同照射時間的菌液1 mL，將其稀釋到合適的濃度（3個梯度），然后分別取0.1 mL在固體完全培養(yǎng)基平板上涂布，每個稀釋度作3個平行，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。待菌落長出后計(jì)數(shù)。

1.2.2 篩選[6-7]按照1.2.1的方法對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，取誘變后的菌液3 mL接入盛有30 mL液體完全培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min培養(yǎng)過夜，取10 mL培養(yǎng)液離心，收集菌體，洗滌后配制成濃度適中的菌懸液；取0.1 mL涂布于二苯胺抗性篩選平板上，20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后，挑選顏色較紅、較大的菌落點(diǎn)接于固體完全培養(yǎng)基平板上，挑選較紅的、生長較快的菌株接到斜面上，并編號保存。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 出發(fā)菌株的致死曲線（見圖2）

圖2 出發(fā)菌株紅法夫酵母AS2.1557的紫外誘變致死曲線

根據(jù)誘變結(jié)果繪制出紅法夫酵母AS2.1557的紫外誘變致死曲線，如圖2所示。一般認(rèn)為紫外誘變的致死率在75%～85%之間時菌株的突變率較高，本實(shí)驗(yàn)選擇80%左右的致死率，即誘變時間為30 s。

2.2 出發(fā)菌株二苯胺抗性檢驗(yàn)

二苯胺是八氫番茄紅素脫氫酶的抑制劑，能抑制類胡蘿卜素的合成。把紅法夫酵母涂布在含二苯胺的平板上，菌落為土白色。但如果細(xì)胞發(fā)生突變，八氫番茄紅素脫氫酶活性不再受二苯胺等抑制劑的抑制，該菌落便是紅色的。實(shí)驗(yàn)研究了不同二苯胺濃度下出發(fā)菌株的生長狀況，其結(jié)果見表1。

表1 不同二苯胺濃度下出發(fā)菌株生長狀況

由表1可以看出，二苯胺在較低濃度下對出發(fā)菌株的生長狀況影響不大；當(dāng)二苯胺濃度增加至50～80 μmol/L時，菌體的生長受到一定的限制，菌落較小，生長緩慢，顏色為土白色；當(dāng)二苯胺濃度增加至150 μmol/L時，菌體的生長受到很大的限制，菌落極小，生長極其緩慢，菌落顏色較難辨別；當(dāng)二苯胺濃度達(dá)到200 μmol/L以上時，菌體的生長受到抑制。

二苯胺不僅抑制紅法夫酵母胞內(nèi)類胡蘿卜素的合成，而且強(qiáng)烈抑制紅法夫酵母的生長。但誘變后需要篩選的是菌落相對較紅的菌株，綜合考慮，誘變后的二苯胺篩選培養(yǎng)基的濃度選為 80 μmol/L。

2.3 高產(chǎn)菌株的篩選

按照方法1.2.1對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，誘變時間為30 s。誘變處理后，取誘變后的菌液3 mL接入盛有30 mL液體完全培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，20℃，160 rpm培養(yǎng)過夜，取10 mL培養(yǎng)液離心，收集菌體，洗滌后配制成濃度適中的菌懸液，取0.1 mL涂布于濃度為80 μmol/L的二苯胺抗性篩選平板上，20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后，挑選顏色較紅、較大的菌落點(diǎn)接于固體完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2～3 d后，挑選較紅生長較快的菌株接到斜面上，并編號保存。最終得到突變株81株，進(jìn)一步篩選，共得到25株菌株，統(tǒng)一編號為Puv-1～Puv-25。

2.4 誘變菌株發(fā)酵性能的測定

2.4.1 高產(chǎn)菌株發(fā)酵性能的測定 對上述篩選的25株菌株進(jìn)行發(fā)酵性能測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，從中可以看出，Puv-7、Puv-11、Puv-16及Puv-24這4株菌的增產(chǎn)幅度較大。

2.4.2 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn) 將得到的4株高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)，連續(xù)液體傳20代，期間測定其發(fā)酵性能，結(jié)果如表3所示。從中可以看出，4株高產(chǎn)突變菌株除Puv-11產(chǎn)量有所下降外，其他3株遺傳性能比較穩(wěn)定。

表2 高產(chǎn)菌株發(fā)酵性能的測定

表3 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)

3 結(jié)果討論

依照出發(fā)菌株紅法夫酵母AS2.1557的紫外誘變致死曲線，選擇致死率在80%左右，即誘變時間為30 s，對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變。經(jīng)過篩選，得到突變株81株，進(jìn)一步篩選，共得到25株菌株。經(jīng)過發(fā)酵性能測定和菌株穩(wěn)定性檢驗(yàn)，最終得到3株穩(wěn)定的高產(chǎn)菌Puv-7、Puv-16、Puv-24，其產(chǎn)量相對原始菌株分別提高了34.7%、35.3%和46%?！?/p>

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