劉 杰 季曉娟 葛 亮 田樹革＊

1．新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830002;2．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830011;3．新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011

葉酸又稱蝶酰谷氨酸 (PGA)［1]，是人和動(dòng)物為維持正常的生理功能而必需從食物中獲得供給的微量有機(jī)物質(zhì)。葉酸缺乏可致孕婦妊高征、先兆子癇、胎盤早剝的發(fā)生率增高;胎盤發(fā)育不良導(dǎo)致自發(fā)性流產(chǎn);其中影響最大的是引起胎兒神經(jīng)管畸形 (NTD)［2]。近年來，我國已在嬰幼兒、老年食品中強(qiáng)化葉酸、乳粉中添加葉酸。因此，建立簡單、快速、準(zhǔn)確的測定各種食物尤其是嬰幼兒、孕婦強(qiáng)化食品中的葉酸含量的方法有重要現(xiàn)實(shí)意義［3]。目前常用的檢測葉酸方法有：比色法、薄層層析法、微生物法、酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法［4－7]。孕鈣片是以碳酸鈣、葡萄糖酸鋅、葉酸、維生素類成分等為主要原料制成的保健食品，具有補(bǔ)充鈣、鋅及葉酸的保健功能，我們采用RRLC(高分離度快速液相色譜)儀對(duì)孕鈣片中的葉酸含量進(jìn)行測定，確定測定葉酸含量及控制的有效方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RRLC(高分離度快速液相色譜)儀［包括G1322A脫氣裝置，G1312B二元高壓泵，G1367C高性能自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316B柱溫箱，G1315C二極管陣列式檢測器，色譜柱Zorbax XDB－C18(4.6×50mm，1.8um)];XP205DR電子分析天平 (梅特勒－托利多儀器上海有限公司);KQ－400DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);TGL－16B離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 樣品與試劑

葉酸對(duì)照品 (購自中國藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純;水為超純水。其它試劑均為分析純，孕鈣片購自新疆特豐藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為 20091218，20091219，20091220。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Zorbax XDB－C18(4.6×50mm，1.8um)，流動(dòng)相：乙腈－5%甲酸 (31：69)，檢測波長：280nm，流速：1.0mL·min－1，柱溫：30℃。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取葉酸對(duì)照品適量于50ml容量瓶中，加0.5%氨水溶液溶解，放入超聲儀中超聲20min，定容，搖勻，制成2ug·mL－1葉酸對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液制備

取本品10片，研細(xì)，混勻，取約1.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入25mL 0.5%氨水溶液，加塞搖勻，放入超聲儀中超聲20min，使葉酸得到充分提取，取出。加入5mL氯仿，劇烈振搖片刻，靜止待分層，取上清液少許于10000r/min離心10min，即得。采用RRLC(高分離度快速液相色譜)儀檢測孕鈣片中葉酸的含量，其色譜圖見圖1。1－為葉酸標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 葉酸含量色譜圖

2.4 線性試驗(yàn)

分別精密量取葉酸對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 ml置10ml量瓶中，加0.5%氨水定容，進(jìn)樣測定，以峰面積(A)對(duì)其濃度 (c)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為A=128.12c+23.46，r=0.9996。表明葉酸濃度在0.2－1.0μg·ml－1范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取葉酸對(duì)照品溶液5uL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定葉酸峰面積，其RSD為1.12%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取孕鈣片樣品溶液5uL，分別在0，2，4，8，12，24h進(jìn)樣，測定葉酸峰面積，其RSD值為1.56%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取孕鈣片粗粉1.0g，共6份，按樣品測定法測定，測得葉酸含量平均值為 0.88mg· g－1，RSD為1.32%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的孕鈣片粗粉0.5g，共6份，分別精密加入葉酸對(duì)照品0.46mg，以下按樣品溶液制備，照上述色譜條件進(jìn)樣測定，其平均回收率為99.28%，RSD為2.65%。結(jié)果見表1。

表1 葉酸加樣回收率結(jié)果

2.9 樣品的測定

按“2.3”方法制備樣品液，精密吸取葉酸對(duì)照品溶液5uL，樣品溶液5uL，分別注入高效液相色譜儀，測定色譜峰峰面積，計(jì)算其含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

我們采用RRLC(高分離度快速液相色譜)儀測定孕鈣片中葉酸的含量，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡便。高分離度快速液相色譜儀具有分離速度快、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種先進(jìn)的分離檢測技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究將有助于葉酸類保健品相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測。

［1]汪錦邦，顧鵬，章德宏，等．葉酸分析方法的研究進(jìn)展［J]．中國食品添加劑，2000，3(6)：49－53．

［2]聶小鳳，許榕仙，李健，等．葉酸在婦產(chǎn)科疾病中的研究現(xiàn)狀［J]．海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(1)：27－29．

［3]呂運(yùn)開，邊超，王燕桓，等．固相萃?。x子對(duì)液相色譜法測定保健品中的葉酸［J]．食品科學(xué)，2009，30(14)：171－174．

［4]劉莉治，羅曉燕，周洪偉，等．高效液相柱后衍生法測定嬰幼兒食品中的葉酸［J]．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(4)：1179－1180．

［5]劉波，王曉工，王心祥，等．高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸［J]．中國乳品工業(yè)，2003，31：39－40．

［6]Dansky LV，Andermann E，Rosenblatt D，et al．Anticonvulsants，folate levels and pregnancy outcome：A prospective study［J]．Ann Neurol，1987，21：76 －82．

［7]Kohashi M ，Inoue K，Sotobayashi H，et al．Microdetermination of folate monoglutamates in serum by liquid chromatography with electroche micaldetection［J]．Chromatogram，1986，382：303－307．