張 希 太

(邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心,河北邯鄲 056001)

誘變育種歷來都是小麥新品種選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要手段。化學(xué)方法誘發(fā)基因突變是小麥遺傳改良的重要途徑之一[1]?；瘜W(xué)誘變具有成本低廉、使用方便、誘變作用專一等特點,是一種發(fā)展迅速的育種手段。近年來國內(nèi)外利用化學(xué)誘變育成的農(nóng)作物品種數(shù)量明顯增加[1]?；瘜W(xué)誘變劑的選擇對化學(xué)誘變的成功與否至關(guān)重要。近半個世紀(jì)以來,各國學(xué)者曾試用了許多化學(xué)物質(zhì)來篩選低毒高效的化學(xué)誘變劑。疊氮化鈉(NaN3)是為數(shù)不多的能應(yīng)用于植物化學(xué)誘變的高效低毒的化學(xué)誘變劑之一。疊氮化鈉易誘發(fā)植物基因的點突變且對人畜無致癌副作用[1]。近年來疊氮化鈉在應(yīng)用于小麥[2,3]、大麥[4]、水稻[5,11]、大豆[9]、玉米[10]等誘變育種方面取得了明顯的效果。為了創(chuàng)造新的小麥品種資源并且探討疊氮化鈉對小麥誘變的處理適宜方法,筆者自2004年起開始疊氮化鈉誘變小麥的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

疊氮化鈉為南開大學(xué)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品,矮抗 58種子由河南科技學(xué)院茹振剛教授贈送。

1.2 試驗方法

(1)種子處理。采用“甘氨酸-鹽酸”緩沖系統(tǒng),緩沖液的 pH值為 3.0;疊氮化鈉為:0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol/L 5種濃度處理;每種疊氮化鈉濃度處理分為兩個,誘變時一個處理用氣泵鼓入空氣,另一個不鼓入空氣。具體處理方法為,每年的 9月下旬,選取飽滿的矮抗 58種子,每個處理選 1 000粒種子,裝入小尼龍袋中,封緊并懸掛標(biāo)簽,總共裝10個種子處理袋。先將種子在室溫下用自來水浸泡 10 h,待種子吸足水分胚開始萌動時將尼龍袋取出,分別放入裝有各疊氮化鈉濃度處理液的燒杯中,打開氣泵向相應(yīng)的燒杯中鼓入空氣,在室溫下連續(xù)處理3 h,將種子袋取出用自來水反復(fù)沖洗。分處理播入試驗田中,調(diào)查出苗率。第二年小麥成熟時按不同處理收割脫粒保存M0代種子。第二年小麥播種時,從各處理的 M0代種子中隨機選取 3 000粒,按處理單穴單粒播種,第三年小麥?zhǔn)崭钋罢{(diào)查各處理的變異情況,并擇優(yōu)選擇單株,以后每年按株系單穴單粒播種,并逐年淘劣選優(yōu)直到獲得穩(wěn)定的株系。

(2)穎苞內(nèi)滴加。用 pH值為 3.0的“甘氨酸-鹽酸”緩沖液配制疊氮化鈉溶液;疊氮化鈉濃度為:0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol/L。在大田小麥的抽穗揚花期,選擇大部分小花正在揚花的矮抗58的麥穗作為誘變材料,在揚花后 2 h開始整穗,去掉尚未開放的小花,在穎片內(nèi)沿柱頭與子房頸分叉處剪去羽毛狀柱頭,立即用微量注射器滴加 10～ 20μL疊氮化鈉溶液于子房頸切口處,然后套袋并掛標(biāo)簽標(biāo)記。4 h后復(fù)滴1次,每濃度處理 100穗。

小麥成熟后按不同處理穗分別收獲脫粒后保存M0代種子。當(dāng)年的9月底在大田中,將不同處理的M0種子按小區(qū)單穴單粒播種。第二年小麥成熟收割前調(diào)查各誘變處理的變異株率、變異類型等。然后選擇優(yōu)良的變異單株,按株系脫粒保存M1代種子。以后每年按株系單穴單粒播種,并逐年選擇直到獲得穩(wěn)定的株系。

(3)生長點注射。注射的疊氮化鈉濃度為:0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol/L,分別用 pH=3.0的“甘氨酸-鹽酸”緩沖液配制成溶液。大田小麥起身拔節(jié)期,在生長健壯的小麥植株上選擇大的分蘗用微量注射器沿著葉鞘扎入小麥分蘗的生長點部位,將疊氮化鈉溶液注射到生長點部位,每一分蘗注射 20～ 30μL,將注射后的分蘗掛標(biāo)簽。小麥成熟后按不同處理分別收獲、脫粒后保存 M0代種子。按相同的方法播種與選擇。

(4)穗莖注射。注射的疊氮化鈉濃度為:0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol/L,分別用 pH=3.0的“甘氨酸-鹽酸”緩沖液配制成溶液。在大田小麥抽穗期,選擇尚未揚花的矮抗 58麥穗作為誘變材料,用微量注射器將不同濃度的疊氮化鈉溶液注射入穗莖的腔內(nèi),每莖注射 30～ 50μL,每濃度處理 100穗。

小麥成熟后按不同處理穗分別收獲脫粒后保存M0代種子。按相同的方法播種與選擇。

1.3 穩(wěn)定變異株系的SSR分子標(biāo)記檢測

(1)模板 DNA的提取。采用 SDS法并參照文獻[6]的方法從樣品小麥暗培養(yǎng)的黃化麥芽中提取DNA,純化后取少量的樣品溶于無菌的超純水中制成濃度約為20 ng/μL的模板液。

(2)PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建與引物的選擇。根據(jù)Roder[7,8]發(fā)表的 SSR引物,隨機選取分布于各對染色體上的 SSR引物45對,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 PCR反應(yīng)采用 25μL體系,其中 Taq DNA聚合酶 (5 U/μL)0.2μL,DNA模板液 0.5μL,上下游引物各1μL,25 mmol/L Mg Cl22μL,2.5 mmol dNTP 1μL,10×buffer 2.5μL,無菌超純水 16.8μL,礦物油15μL。PCR反應(yīng)在英國T ECHNE公司生產(chǎn)的TC-5000 PCR儀上進行。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性 5 min,94℃變性 50 s,50℃退火 50 s,72℃延伸 1 min(30個循環(huán));72℃后延伸 5 min,4℃保存。

(3)擴增產(chǎn)物的檢測。擴增產(chǎn)物采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,每泳道上樣量為8μL,在 200 V恒電壓下電泳 2.5 h,剝膠,銀染,照相,進行擴增條帶的分析。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 不同疊氮化鈉濃度、不同誘變處理方法對M0代種子發(fā)芽率的影響

表 1 疊氮化鈉不同濃度處理的M0代種子發(fā)芽率(%)Table 1 Gemination rate of M0seeds each treatment

據(jù)田間調(diào)查,疊氮化鈉溶液誘變處理的小麥種子大田播種后出苗明顯推遲,長出的麥苗明顯細(xì)弱,生長發(fā)育緩慢,部分弱苗在越冬時死亡。表 1數(shù)據(jù)顯示,疊氮化鈉溶液誘變小麥種子時隨著疊氮化鈉濃度的提高對種子的生理損傷加大,M0代種子的發(fā)芽率迅速下降。種子誘變處理時用氣泵鼓入空氣的處理,M0代種子的發(fā)芽率明顯高于不鼓入空氣的處理。這是因為不鼓入空氣處理的小麥種胚除受到誘變劑的損傷外,還受到了無氧呼吸的損傷,被處理種子的發(fā)芽率明顯降低;穎苞內(nèi)滴加、生長點注射、穗莖注射 3種方法誘變處理的 M0代種子,大田播種后出苗、生長發(fā)育都比較正常。表1數(shù)據(jù)顯示,這3種方法誘變處理的M0代種子的發(fā)芽率幾乎不受疊氮化鈉的影響。分析其原因可能是在種子發(fā)育的早期,受疊氮化鈉毒害損傷嚴(yán)重的子房、合子、早期的胚胎都未能發(fā)育成種子而夭折,受誘變劑損傷較輕或未受損傷的子房、合子、早期的胚胎才發(fā)育成了健康的種子,所以它們的M0代種子的發(fā)芽率幾乎都為100%。

2.2 不同疊氮化鈉濃度、不同誘變處理方法對M1代種子變異率的影響

據(jù)田間調(diào)查結(jié)果,疊氮化鈉誘變種子的處理M1代群體植株的變異率明顯高于穎苞內(nèi)滴加、生長點注射、穗莖注射 3種方法,且隨著疊氮化鈉濃度的提高,M1代群體的變異率也提高;種子誘變處理時鼓入空氣的處理M1代群體的變異率明顯高于不鼓入空氣的處理,且不鼓入空氣處理的 M1代群體的變異率隨疊氮化鈉濃度增加而提高的幅度較小。分析其原因,誘變處理時鼓入空氣的小麥種子受無氧呼吸的損傷較小,受疊氮化鈉損傷較嚴(yán)重的種子得以存活,而在不鼓入空氣的處理中無氧呼吸和誘變劑疊氮化鈉同時對種子造成損傷,使得受疊氮化鈉損傷較嚴(yán)重的種子未能存活,因此鼓入空氣處理的 M1代群體變異率高于不鼓入空氣的處理。穎苞內(nèi)滴加和生長點注射兩種誘變方法,當(dāng)疊氮化鈉濃度較低(0.5 mmol/L)時沒有誘變效果,只有當(dāng)疊氮化鈉濃度大于 1 mmol/L時,M1代群體中才有少量的變異株出現(xiàn),且變異率隨疊氮化鈉濃度的提高增幅不大。分析其原因,在穎苞內(nèi)滴加誘變時,疊氮化鈉溶液中的-N3-1離子需要通過極細(xì)的花粉管才能到達(dá)胚囊中誘變合子或早期的胚胎細(xì)胞,由于花粉管內(nèi)徑的限制,盡管提高了疊氮化鈉濃度,但是能到達(dá)胚囊中的疊氮化鈉溶液的量是有限的,所以其誘變率較低且M1代群體的誘變率隨疊氮化鈉濃度提高變化不大。生長點注射誘變時,雖然疊氮化鈉溶液直接注射倒了生長點部位但注入的量較少,生長點部位被誘變的細(xì)胞也較少,這些被誘變的細(xì)胞在分化過程中又只有很少一部分形成生殖細(xì)胞將變異遺傳給后代,所以其M1代群體變異率很低。穗莖注射疊氮化鈉溶液的誘變方法沒有效果。這從疊氮化鈉誘變植物的原理中不難得到解釋,疊氮化鈉本身沒有誘變作用,它的誘變作用是在植物細(xì)胞內(nèi)通過半胱氨酸合成酶代謝產(chǎn)生的,半胱氨酸合成酶能利用疊氮化鈉溶液中的-N3-1代替硫化物合成β-疊氮丙氨酸而作用于細(xì)胞的基因組 DNA使其發(fā)生變異。穗莖注射時疊氮化鈉接觸的是穗莖部位的細(xì)胞,沒有接觸穗部的生殖細(xì)胞,所以其后代沒有變異產(chǎn)生。

表 2 疊氮化鈉不同濃度處理的M1代群體變異率(%)Table2 Variation rate of M1plants each treatments

2.3 不同疊氮化鈉濃度、不同誘變處理方法的M1代群體變異類型

表 3顯示,種子處理(Ⅰ ,Ⅱ )的 M1代群體變異類型比較豐富,和對照相比主要表現(xiàn)在株高的變異、葉片蠟質(zhì)層的有無、芒的有無、穗型的改變、成熟期長短,同時還出現(xiàn)了不能成活的葉綠素缺失的白化與黃化株以及不能正常繁殖后代的不育株;穎苞內(nèi)滴加、生長點注射(Ⅲ ,Ⅳ )兩種誘變方法處理的 M1代群體變異率低,變異類型不豐富,僅出現(xiàn)了矮稈植株、葉片無蠟質(zhì)層植株、不育株和葉綠素缺失株。

從 M1代開始對變異群體擇優(yōu)選擇,淘汰劣變單株,一般從M3代開始有穩(wěn)定的變異系出現(xiàn)。經(jīng)過多代的選擇已從疊氮化鈉誘變矮抗58的變異系中選出3個各具特色的穩(wěn)定種質(zhì)系,分別為 Y58-1,Y58-5,Y58-7。

2.4 疊氮化鈉誘變矮抗58變異種質(zhì)系的SSR分子標(biāo)記檢測結(jié)果

表 3 各處理M1代群體性狀變異類型Table 3 Variation assortments of M1plants each treatments

SSR分析采用的引物為:xgwm120,xgwm135,xgwm140,xgwm148,xgwm155,xgwm160,xgwm179,xgwm194,xgwm213,xgwm219,xgwm257,xgwm260,xgwm261,xgwm268,xgwm272,xgwm293,xgwm294,xgwm295,xgwm297,xgwm301,xgwm304,xgwm311,xgwm328,xgwm334,xgwm339,xgwm357,xgwm400,xgwm408,xgwm428,xgwm437,xgwm469,xgwm493,xgwm499,xgwm614,xgwm617,xgwm642,xgwm645。其中 xgwm213,xgwm219,xgwm400,xgwm428引物檢測出了豐富的多態(tài)性片段(圖 1)。

3 小結(jié)與討論

(1)疊氮化鈉是一種高效且對哺乳類動物無毒害作用的植物化學(xué)誘變劑。本試驗結(jié)果表明,疊氮化鈉對小麥有較強的誘變效應(yīng),能使小麥在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、葉綠素、育性、生育期等方面發(fā)生性狀變異。在本試驗濃度范圍(0～2.0 mmol/L)內(nèi)隨著疊氮化鈉濃度的提高對小麥的誘變效應(yīng)增強。

(2)在本試驗采用的誘變處理方法中,用 pH值3.0的疊氮化鈉溶液處理種子并同時鼓入空氣的方法處理后種子出苗率高,后代性狀變異類型豐富,變異率高,是適合小麥誘變處理的一種切實可行的方法。

(3)通過 SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測矮抗 58,Y58-1,Y58-5,Y58-7的基因組DNA,從分子水平上證明了疊氮化鈉對小麥的誘變效果。

圖 1 4個引物檢測結(jié)果Fig.1 Consequence of Primer xgwm 213(a),xgwm219(b),xgwm400(c),xgwm 428(d)

(4)利用疊氮化鈉進行化學(xué)誘變是創(chuàng)造小麥新種質(zhì)、選育小麥新品種的有效途徑之一,因其具有可能突變出新基因優(yōu)勢,可以與常規(guī)育種手段結(jié)合,對擴大遺傳變異、提高育種效率、改進育種方法有著很大潛力。

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