謝 輝 陶連方

湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院（湖北十堰 442100）

三七總皂苷對新生大鼠心肌細胞肥大的影響及機制

謝 輝 陶連方△

湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院（湖北十堰 442100）

目的 在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞上，觀察三七總皂苷對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的心肌細胞肥大的影響。方法采用MTT法檢測細胞毒性；采用相差顯微鏡測量細胞大小，3H-亮氨酸摻入法測定心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率作為心肌細胞肥大的指標；RT-PCR檢測心肌細胞原癌基因c-fos mRNA的表達。結(jié)果三七總皂苷能抑制AngⅡ誘導的心肌細胞增大，蛋白質(zhì)合成速率的顯著增加及心肌細胞原癌基因c-fos mRNA表達的增強，其效果與AngⅡ受體阻滯劑纈沙坦相似。結(jié)論三七總皂苷可以抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，這與其抑制了原癌基因c-fos的表達有關(guān)。

血管緊張素Ⅱ 三七總皂苷 心肌細胞肥大 c-fos

△通信作者

三七總皂苷（Panax notoginseng saponin）是五加科植物三七[Panax notoginseng（Burk．） F．H．Chen]的主要活性成分，含量約為12%；可抑制血栓形成，擴張外周血管，保護缺血性心肌細胞損傷，降低血壓，治療心腦血管疾病療效顯著[1-2]。已有研究表明三七總皂苷具有改善心功能保護缺血心臟的作用[3-4]。但其是否從細胞水平影響心肌細胞凋亡而發(fā)揮對心肌細胞的保護作用，文獻少有報道。為此，本實驗以AngⅡ誘導新生乳鼠心肌細胞凋亡為模型[5]，觀察三七總皂苷對心肌細胞凋亡的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：1～3d齡wistar大鼠，雌雄不拘（湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心提供）。（2）試劑與儀器 ：AngⅡ（Sigma公司）、三七總皂苷（麗珠集團利民制藥廠，批號0711129）、纈沙坦 （北京諾華制藥公司饋贈），DMEM干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、TRIZOL（Gibco公司），3H-亮氨酸（中科院上海原子能研究所），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司），PCR引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，其余試劑為國內(nèi)目前最優(yōu)質(zhì)的化學試劑；Dynatech MR580顯微ELISA讀數(shù)器 （Shimazu）；LS3810液體閃爍儀（Beckman公司）；基因擴增儀（Ferrotec公司）。

1.2 實驗分組 （1）對照組；（2）AngⅡ（10-6mol/L）組；（3）AngⅡ（10-6mol/L）＋三七總皂苷 （10-8g/L）組；（4）AngⅡ（10-6mol/L）＋纈沙坦（10-6mol/L）組；（5）三七總皂苷（10-8g/L）組；（6） 纈沙坦 （10-6mol/L）組。

1.3 新生大鼠原代心肌細胞培養(yǎng) 參照文獻[6]，在無菌條件下取出大鼠心室，在4℃ D-Hanks液中剪碎，用0.1%的胰蛋白酶消化成單細胞懸液。為了選擇性收集心肌細胞，加入20%的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中差速貼壁1～2h除去非心肌細胞，吸出未貼壁的心肌細胞稀釋成1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔2mL。在培養(yǎng)的前48h，加入0.1mmol/L 5-溴脫氧尿苷抑制非心肌細胞的增殖，然后換無血清培養(yǎng)液。

1.4 細胞毒性的測定 將心肌細胞置于96孔的微孔板培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液后，將PBS中加上高濃度的三七總皂苷，孵育24h后，用 MTT 法檢測細胞毒性[3]，每孔（10μL/100μL 培養(yǎng)液）加入MTT溶液 （5mg/mL），在37℃中孵育4h，每孔加入酸-異丙醇（100μL,0.04mol/L的HCL于異丙醇中），徹底混勻至深藍色結(jié)晶溶解。在室溫下靜置幾分鐘（保證所有的晶體溶解）。然后把培養(yǎng)板置于Dynatech MR580顯微ELISA讀數(shù)器中讀數(shù)，選用570nm的測試波長和630nm的參照波長。

1.5 心肌細胞大小的測定 心肌細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，每24h按分組加藥1次，48h換液1次，加藥持續(xù)作用7d后，0.25%的胰酶消化使之脫落，在相差顯微鏡下用測微器測細胞直徑，每孔觀察10個視野，每個視野測10個細胞，取其平均值。

1.6 心肌細胞3H-亮氨酸摻入測定 心肌細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，加入AngⅡ、三七總皂苷、纈沙坦和18.3kBq 3H-亮氨酸繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞于玻璃纖維素膜上，10%的三氯乙酸固定，濾膜烘干后用LS3810液體閃爍儀測定放射強度。

1.7 心肌細胞總RNA提取 收獲2×105個心肌細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA。每孔細胞加入Trizol試劑2mL，經(jīng)氯仿和異丙醇抽提后，將所得的RNA溶于少量無Rnase水中，紫外分光光度計測定其濃度和純度，重復測定3次，計算樣品總RNA濃度：OD260∶280比值在1.8～2.0之間。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 采用 Yang等[4]設(shè)計的 c-fos 引物 （上游：5′-GGT CAT CGG GGA TCT TGC-3′，下游：5′-GGG CTC TCC TGT CAA C-3′），擴增片段長度為 510bp；內(nèi)參 β-actin （上游：5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′，下游 5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′），擴增片段長度為205bp。按照RT-PCR試劑盒的說明，進行目的基因擴增。 RT-PCR 條件為：（1）cDNA 合成和預變性 37℃ 60min，94℃5min；（2）PCR 擴增：94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 50s進行 30 次循環(huán)（c-fos擴增10個循環(huán)后，再加入內(nèi)參引物進行余下的20個循環(huán)）。 （3）延伸：72℃ 5min。 取 RT-PCR 產(chǎn)物 5μL，加 2μL 上樣緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠 （含溴化乙錠0.5μg/μL）電泳 25min，用GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP）掃描定量，并計算與β-actin的比值。

2 結(jié) 果

2.1 三七總皂苷和纈沙坦對AngⅡ誘導的心肌細胞大小的影響 見表1。AngⅡ持續(xù)作用7d后，心肌細胞直徑明顯增大（P＜0.05）；三七總皂苷和纈沙坦均能抑制這種心肌細胞大小的改變（P＜0.05）。

表1 各組心肌細胞大小比較 （±s）

表1 各組心肌細胞大小比較 （±s）

與對照組比較，*P＜0.05。與AngⅡ組比較，△P＜0.05。

組 別對照組AngⅡ組AngⅡ+三七總皂苷組細胞直徑（μm）18.90±1.80 29.90±3.50*22.10±2.70*AngⅡ+纈沙坦組三七總皂苷組20.00±2.90*19.40±2.80纈沙坦組合成速率（cpm）1210±123 1908±104 1408±110△1368±108△1198±121 1215±12019.10±2.50

2.2 三七總皂苷和纈沙坦對心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率的影響AngⅡ作用24h后，心肌細胞合成速率AngⅡ組較對照組明顯增加（P＜0.01），三七總皂苷組和纈沙坦組對心肌細胞蛋白質(zhì)合成沒有影響，但均能抑制AngⅡ刺激的心肌蛋白質(zhì)合成速率的增加（P＜0.05）。

2.3 三七總皂苷和纈沙坦對原癌基因c-fos mRNA表達的影響在培養(yǎng)液中加入AngⅡ作用30min后，c-fos mRNA的表達顯著增強（P＜0.01），預先加入三七總皂苷或纈沙坦作用30min，可阻斷AngⅡ的作用（P＜0.01），而三七總皂苷和纈沙坦本身對原癌基因c-fos mRNA的表達無影響。見圖1。

圖1 三七總皂苷和纈沙坦對AngⅡ誘導的心肌細胞原癌基因c-fos mRNA表達的影響

3 討 論

許多刺激因子如機械牽張、AngⅡ、內(nèi)皮素（ET-1）均可引起心肌肥厚[7]。為了探討三七總皂苷對心肌肥厚的作用，以上實驗研究了三七總皂苷對AngⅡ誘導的心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率及原癌基因c-fos mRNA表達的影響，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以減少AngⅡ所致的心肌細胞細胞凋亡，從而抑制心肌細胞肥大，其效果與AT1受體拮抗劑相似。

大量研究表明，三七總皂苷是一選擇性的慢鈣通道阻滯劑[8-10]，AngⅡ使蛋白激酶C活性增加并伴隨胞漿內(nèi)Ca2+濃度增高[11]，AngⅡ增加Ca2+依賴的內(nèi)源性核酸酶的活性，導致DNA 斷裂[12]，從而導致心肌細胞凋亡。細胞內(nèi)Ca2+升高被認為是導致細胞凋亡的最后通路，抑制細胞內(nèi)Ca2+超載可降低細胞凋亡的發(fā)生。由此我們推測：三七總皂苷抑制AngⅡ誘導的心肌肥厚可能是通過降低心肌細胞Ca2+變化，阻斷MAPK和CaN途徑將肥大信號傳入核內(nèi)，從而抑制立原癌基因c-fos mRNA的表達而實現(xiàn)的。

[1]Dong T X，Cu i X M，Song Z H，et al.Chem ical assessm ent o froo ts o f Panax notog inseng in China：reg iona l and seasonal va riations in its active constituents[J].J Ag ric Food Chen，2003，51（6）：4617-4623.

[2]周燕，田磊，莫寧.三七總皂苷抗心肌肥大的作用與其影響神經(jīng)體液因素的關(guān)系[J].中國中藥雜志，2005，30（12）：916-919.

[3]張曉文，饒曼人.參三七皂苷Rg1預適應對肥厚乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的保護[J].中國臨床康復，2003，7（12）：1750.

[4]秦鑒，孟君，金明華，等.人參三七煎劑對缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2004，4（17）：323.

[5]Kajstura J，Cigola E，malhot ra A，et al.Angiot ensin induces apopt osis of aldult vent ricular myocytes in vitro[J].J Mol cell Cardiol，1997，29（4）：859.

[6]Sadoshima J，Izumo S.Molecular characterization of angiotensinⅡ-inducedhypertrophyofcardiacmyocytesandhyperplasiaofcardiacfibroblasts[J].CreRes，1993，73（5）：413-423.

[7]Hefti M A，Hander B A，Eppenberger et al.Signaling of pathways in cardiac myocyte hypertrophy [J].J Mol Cell Cardiol，1997，29（5）：2873-2892.

[8]朱智勇，王曉晴，楊映寧，等.三七總皂苷對慢性低氧大鼠右心室心肌細胞鈣電流的影響[J].中國病理生理雜志，2004，20（3）：399.

[9]Kwan C Y，Kwan T K.Effects of Panax not oginseng saponins on vascular endothelial cells in vitro[J].Acta Phar amacol Sin，2000，21（12）：1101.

[10]繆麗燕，關(guān)永源，孫家鈞.三七皂苷單體Ca2+內(nèi)流作用的研究[J].中國藥理學通報，1996，12（1）：39.

[11] Force T，Haq S，Kilter H ，et al.Apopt osis signal regulat ing kinase/nuclear factor kappa B：a novel signaling pathw ay regulat es cardiomyocyt e hypert rophy[J].Circulation ，2002，105（4） ：402.

[12] Kajstura J，Cigola E，Malhotra A，et al.Angiot ensin inducesapopt osis of aldult vent ricular myocytes in vitro[J].J Mol cell Cardiol，1997，29（4）：859.

R285.5

A

1004-745X（2011）09-1444-02

2011-05-11）