陳 浩 ，王興啟 ，崔桂云 ，趙 輝 ，宋遠(yuǎn)見(jiàn) ，高 麗 ，荊 佳 ，沈 霞

（1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 221004；2.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210093；3.徐州市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 221009；4.徐州醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004；5.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210029）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是神經(jīng)科常見(jiàn)的急、危、重癥，其發(fā)病率、致殘率及死亡率均很高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。研究證實(shí)Hb與出血后腦損傷密切相關(guān)，作為Hb的分解代謝限速酶HO-1對(duì)疾病的發(fā)展具有重要影響。研究證實(shí)，誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷而過(guò)高表達(dá)卻會(huì)進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞損傷[1-2]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)3～30μmol/L Hb誘導(dǎo)的HO-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用[3]，那么更高濃度的Hb誘導(dǎo)的HO-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)將選擇更高濃度的 Hb（40μmol/L）誘導(dǎo) HO-1表達(dá)，觀(guān)察 HO-1對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，研究結(jié)果將為進(jìn)一步了解Hb誘導(dǎo)的HO-1在出血性腦疾病中的作用提供新觀(guān)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠（1 d），由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；HO-1羊多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；Hb、ZnPPIX、β-actin 兔單克隆抗體、Bax小鼠單克隆抗體、Bcl-2兔單克隆抗體、p-JNK小鼠單克隆抗體及JNK兔單克隆抗體購(gòu)于Cell Signal公司；GFAP兔單克隆抗體購(gòu)于博士德公司；CCK-8購(gòu)于日本同仁公司；Hoechst 33342試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)于天根生物公司。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

參照DALLAS等[4]的方法，取新生24 h內(nèi)的SD大鼠，超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下斷頭取腦分離出大腦皮層剪碎，胰酶消化、離心、吹打及過(guò)濾后，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入37℃，5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5～7 d傳代1次，傳到第3代時(shí)，采用GFAP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.3 分組

實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組（Control組，簡(jiǎn)寫(xiě)：C組）：僅用DMEM培養(yǎng)基；Hb組：含有40 μmol/L Hb的DMEM培養(yǎng)基及Hb+ZnPPIX組（簡(jiǎn)寫(xiě)：HZ組）。10 μmol/L ZnPPIX預(yù)孵育2 h，吸出后再加入含40 μmol/L Hb的DMEM培養(yǎng)基。Hb作用時(shí)間為6 h。

1.4 Hoechst 33342細(xì)胞核染色

將第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞種于24孔板內(nèi)，干預(yù)處理后，用預(yù)冷的PBS漂洗后加入預(yù)冷的4%多聚甲醛，加200μL/孔的Hoechst 33342染色液，室溫放置3～5 min，吸盡Hoechst 33342染色液，PBS漂洗，選用340 nm的激發(fā)光觀(guān)察。在20×10倍下每組至少選擇4個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡率，并且避開(kāi)培養(yǎng)孔的四周區(qū)域。

1.5 CCK-8測(cè)定細(xì)胞存活率

將星形膠質(zhì)細(xì)胞種于96孔板，干預(yù)處理，同時(shí)設(shè)一空白對(duì)照組（未進(jìn)行任何處理），陰性對(duì)照組（不加CCK-8），其他實(shí)驗(yàn)組用滅菌的PBS漂洗1遍，每孔加 100μL的 DMEM培養(yǎng)基后再加入 10μL CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)各孔吸光度。

1.6 Western blot檢測(cè) HO-1、Bax和Bcl-2的表達(dá)

取等量蛋白樣品加入10%SDS-PAGE分離后，以半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜上，加入脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2 h；分別加入稀釋的一抗，4℃過(guò)夜；次日洗脫緩沖液洗膜，分別加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，洗膜；BCIP/NBT顯色后條帶經(jīng)圖像處理儀進(jìn)行激光掃描、定量分析及打印。蛋白激活水平以免疫印跡中相應(yīng)條帶的灰度值相對(duì)于內(nèi)參組的比值來(lái)表示。

1.7RT-PCR檢測(cè)HO-1的mRNA

按上述分組處理完畢后，參照總RNA抽提說(shuō)明書(shū)對(duì)總RNA進(jìn)行抽提，逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)。HO-1的上下游引物：5'-ACGGCCCTGGAAGAGGA-GATAG-3'和5'-GAGTGTTCATGCGAGCACGATAG-3'（PCR條件：退火溫度60℃，30個(gè)循環(huán)）；β-actin上下游引物：5'-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'和 5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'（PCR 條件：退火溫度60℃，30個(gè)循環(huán)）。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后，將凝膠放于Tanon凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定結(jié)果

星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代至第3代時(shí)應(yīng)用GFAP抗體免疫熒光鑒定，陽(yáng)性率達(dá)97%，結(jié)果說(shuō)明絕大多數(shù)細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定結(jié)果（GFAP標(biāo)記，×200）

圖2 RT-PCR及Western blot法檢測(cè)HO-1的mRNA及蛋白表達(dá)變化

2.2 Western blot及RT-PCR法檢測(cè)HO-1的變化

Western blot及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組HO-1蛋白及mRNA的表達(dá)情況，每組分別重復(fù)3次后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，分析結(jié)果顯示：Hb組、HZ組與C組相比，HO-1蛋白及其mRNA表達(dá)量明顯增多，P＜0.001差異有顯著性；HZ和Hb相比，HO-1表達(dá)降低，但P＞0.05差異無(wú)顯著性。見(jiàn)圖2。

2.3 Hoechst 33342核染色觀(guān)察細(xì)胞損傷

分析結(jié)果說(shuō)明：Hb組、HZ組和C相比，細(xì)胞凋亡率明顯升高，P＜0.001差異有顯著性；HZ組和Hb相比，細(xì)胞凋亡率顯著降低，P＜0.01差異有顯著性。見(jiàn)圖3和附表。

附表 各組Hoechst 33342核濃染率及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率的比較 %

2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

CCK-8檢測(cè)結(jié)果示：Hb組、HZ組和C相比，細(xì)胞存活率明顯降低，P＜0.001差異有顯著性；HZ和Hb相比，細(xì)胞存活率明顯提高，P＜0.01差異有顯著性。見(jiàn)附表。

圖3 Hoechst 33342核染色觀(guān)察各組細(xì)胞損傷情況

2.5 Western blot進(jìn)一步檢測(cè) Bcl-2、Bax及p-JNK的變化情況

圖4 Western blot檢測(cè)各組p-JNK、JNK、Bcl-2和Bax變化情況

結(jié)果顯示：Hb組、HZ組與C組相比，Bcl-2/Bax的比值下降，而p-JNK/JNK比值上升，P＜0.01差異都有顯著性；HZ組與Hb相比，Bcl-2/Bax的比值上升，而p-JNK/JNK比值下降，P＜0.05差異都有顯著性。見(jiàn)圖4。

3 討論

Hb約占成熟紅細(xì)胞蛋白總量的95.00%，ICH發(fā)生時(shí)紅細(xì)胞裂解釋放出大量的Hb，而Hb會(huì)進(jìn)一步分解產(chǎn)生大量血紅素。因此，將導(dǎo)致出血周?chē)窠?jīng)組織暴露于血紅素中。ICH導(dǎo)致的腦損傷主要是由氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等引起的，而Hb代謝產(chǎn)生的血紅素是ICH腦損傷中過(guò)氧化劑和自由基的重要來(lái)源。血紅素可以被其分解代謝限速酶血紅素氧合酶繼續(xù)分解代謝為鐵、一氧化碳及膽綠素。目前發(fā)現(xiàn)HO存在 3種同工酶：HO-1、HO-2和HO-3。HO-1又稱(chēng)熱休克蛋白-32，為可誘導(dǎo)型，可被多種因素如重金屬、熱休克、缺血-再灌注、缺氧、高氧和Hb等誘導(dǎo)表達(dá)；HO-2及HO-3為原生型在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)[5]。雖然HO-1可以分解代謝血紅素降低其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用，但目前有關(guān)HO-1在神經(jīng)細(xì)胞損傷或保護(hù)中的作用卻存在著爭(zhēng)議[1-2]，這主要與HO-1被誘導(dǎo)表達(dá)的水平情況有很大關(guān)系。MOON等研究發(fā)現(xiàn)梓實(shí)糖苷能通過(guò)誘導(dǎo)Neuro-2a高表達(dá)HO-1抵抗過(guò)氧化氫的損傷[6]；然而又有研究證實(shí)HO-1能夠加重ICH發(fā)生后早期腦損傷[2]。那么不同濃度的Hb誘導(dǎo)的HO-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用如何呢？RAYMOND F.REGAN發(fā)現(xiàn)3～30 μmol/L Hb誘導(dǎo)的HO-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，但本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)40 μmol/L Hb誘導(dǎo)的HO-1對(duì)離體星形膠質(zhì)細(xì)胞卻有損傷作用。

在本研究中星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷是否與HO-1過(guò)高表達(dá)有關(guān)，筆者采用了HO的活性抑制劑ZnPPIX抑制HO-1的活性，觀(guān)察星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷情況。值得注意的是，大量的研究已經(jīng)證實(shí)ZnPPIX對(duì)HO-1的表達(dá)沒(méi)有影響但對(duì)HO-1的活性有很強(qiáng)的抑制作用[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ZnPPIX可減輕40μmol/L Hb對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用。

為觀(guān)察40μmol/L Hb誘導(dǎo)的HO-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，本組通過(guò)RT-PCR及Western blot檢測(cè)HO-1的mRNA及蛋白表達(dá)量并利用CCK-8及Hoechst 33342核染色檢測(cè)細(xì)胞活力變化及細(xì)胞核濃染情況。結(jié)果顯示當(dāng)HO-1蛋白被誘導(dǎo)過(guò)高表達(dá)時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯損傷發(fā)生，而ZnPPIX作用后損傷明顯減輕。研究發(fā)現(xiàn)JNK、Bcl-2和Bax等蛋白參與多種細(xì)胞的存活或凋亡過(guò)程，且目前已有大量研究證實(shí)它們也與神經(jīng)細(xì)胞的存活或凋亡有關(guān)系[8]。Bcl-2和Bax二者含量和功能狀態(tài)之間的平衡是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。研究認(rèn)為在一定范圍內(nèi)，Bcl-2/Bax的比值增高時(shí)對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，但比值減小時(shí)則對(duì)細(xì)胞有損傷作用[9-10]。JNK被磷酸化激活后可促進(jìn)Bax的表達(dá)而下調(diào)Bcl-2，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果顯示當(dāng)HO-1蛋白被誘導(dǎo)過(guò)高表達(dá)時(shí)p-JNK/JNK的比值明顯升高，Bcl-2/Bax的比值則明顯下降；而ZnPPIX作用后p-JNK/JNK的比值降低，而B(niǎo)cl-2/Bax的比值則明顯上升。Western blot結(jié)果與CCK-8及Hoechst 33342檢測(cè)結(jié)果一致。以上結(jié)果說(shuō)明，40μmol/L Hb作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后HO-1的表達(dá)水平過(guò)高，進(jìn)而降低細(xì)胞存活率，提高JNK磷酸化水平及降低Bcl-2/Bax比值，增加細(xì)胞核濃染率促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明40μmol/L Hb誘導(dǎo)的HO-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有損傷作用，此研究結(jié)果豐富了對(duì)HO-1在Hb導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的認(rèn)識(shí)。此外，本研究結(jié)果也進(jìn)一步解釋了HO-1能夠加重ICH發(fā)生后腦損傷的原因，這可能是病人發(fā)生ICH后出血周?chē)X組織中HO-1的表達(dá)量已超過(guò)其具有神經(jīng)保護(hù)作用的水平而處于過(guò)高表達(dá)狀態(tài)，其后果會(huì)加重神經(jīng)組織中如星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。以上認(rèn)識(shí)將對(duì)ICH發(fā)生后腦損傷的有效防治提供相關(guān)理論依據(jù)。

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