吳珍，陳永順，王啟斌

(湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院1.消化內科;2.藥學部，湖北十堰442000)

草豆蔻主要化學成分為黃酮類和揮發(fā)油。草豆蔻總黃酮具有健胃、止吐、抑制血小板聚集和腫瘤形成、抗炎抑菌等藥理作用[1-3]。筆者在本實驗中研究草豆蔻總黃酮的體內外抗氧化活性，并與茶多酚的抗氧化性能比較，以期為深入開發(fā)應用該藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與儀器草豆蔻藥材(購自湖北省十堰市宏康藥材公司，批號:20100215，經(jīng)我院中藥房鑒定為姜科山姜屬植物草豆蔻種子)，二苯代苦味酰肼自由基(2，2 diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，Sigma公司)，茶多酚(湖北武漢浩河化工廠，純度≥98.8%，批號:20090621)，番紅花紅(溫州市甌海精細化工公司，批號:20090317)，維生素E(浙江新和成股份公司，批號:20100106)，D-半乳糖(上海試劑廠，批號:F20090108)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(上海超研生物科技有限公司，批號:20090230)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(上海超研生物科技有限公司，批號:20090407)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±2.0)g，湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCYY(鄂)2004-0012。

2 方法與結果

2.1 草豆蔻總黃酮的提取[4]精密稱取草豆蔻粉末200 g，過內徑0.600 mm(30目)篩，用8倍量95%乙醇回流提取兩次，每次2 h，提取液減壓濃縮至含醇量約10%，抽濾，除去雜質，加60%乙醇定容至100 mL，作為供試品溶液，備用。經(jīng)測定，總黃酮含量為6.82%。

2.2 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)使用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差±s)表示，組間比較采用t檢驗。

2.3 體外抗氧化實驗

2.3.1 DPPH法DPPH是一種較為穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm波長處有吸收峰。測試時分別以50%乙醇將茶多酚、草豆蔻總黃酮提取液配制成相應濃度。按文獻[5]方法測定，分別在517 nm波長處測定不同濃度樣品2 mL加DPPH 2 mL的吸光度(Ai)，不同濃度草豆蔻總黃酮樣品2 mL加50%乙醇2 mL的吸光度(Aj)，50%乙醇2 mL加DPPH2 mL的吸收光度(A0)。實驗平行3次，草豆蔻總黃酮樣品及對照品分別測8個濃度，以50%乙醇作為空白。草豆蔻總黃酮樣品對DPPH自由基的清除能力(SA)可采用以下公式計算:SA(%)=[1－(Ai－Aj)]/A0×100%。結果見圖1。

草豆蔻總黃酮與茶多酚對DPPH自由基都表現(xiàn)出明顯的清除活性，清除作用隨濃度的增加而增強，茶多酚對DPPH自由基的清除能力強于草豆蔻總黃酮，當濃度達到10 mg·mL-1時，兩者對DPPH自由基的清除能力相近，最大清除率可達78%。

2.3.2 草豆蔻總黃酮清除羥自由基活性測定[6]采用Fe(Ⅱ)催化過氧化氫(H2O2)產(chǎn)生羥自由基(Fenton反應)，該反應產(chǎn)生的羥自由基可使番紅花紅褪色。針對這一特點來研究草豆蔻總黃酮對羥自由基的清除能力。取0.15 mol·L-1pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，40 μg·L-1番紅花紅1.0 mL，0.945 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)-Fe(Ⅱ)(新鮮配制)1.0 mL，不同濃度的樣品溶液0.5 mL、3%H2O21.0 mL(新鮮配制)，混合后在37℃水浴中反應30 min后在520 nm波長處測定吸光度(As)?？瞻捉M以純化水0.5 mL代替樣品測定吸光度(A0)，對照組以純化水1.5 mL代替H2O2和樣品測定吸光度(A)，用純化水3.5 mL代替番紅花紅、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、樣品，磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，調零。并按下式計算清除率:清除率(%)=(As－A0)/(A－A0)×100%，結果見圖2。

當草豆蔻總黃酮的濃度≥0.8 mg·mL-1時，清除率達到最大，最大清除率為88.5%，而此時茶多酚的清除率為58.5%，表明同濃度時，草豆蔻總黃酮對羥自由基的清除活性強于茶多酚。

2.3.3 抑制脂質過氧化活性測定取大豆卵磷脂溶液0.5 mL(大豆卵磷脂200 mg溶解于10 mmol·L-1pH7.4磷酸鹽30 mL，冰浴震蕩)，加入pH7.14磷酸鹽緩沖液1.0 mL，不同濃度的樣品溶液1 mL，2.5 mmol·L-1EDTA-Fe(Ⅱ)1.0 mL，混勻后于37℃水浴中反應45 min，再加入28%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)2.0 mL，1%硫代巴比妥鈉(thiobar bituric acid，TBA)1.0 mL，混勻后置于100℃沸水浴中加熱10 min，冷卻后在532 nm波長處測定吸光度(A樣)，用磷酸鹽緩沖液調零，空白管用磷酸鹽緩沖液代替樣品測吸光度(A0)。并按下式計算抑制率:抑制率(%)=(A0－A樣)/A0×100%。從圖3中可以看出，草豆蔻總黃酮與茶多酚對卵磷脂過氧化物的抑制作用相近，濃度≥1.0 mg·mL-1時，草豆蔻總黃酮的最大抑制率91.5%。

2.3.4 清除超氧陰離子自由基活性測定[7]取0.05 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH=8.2)4.5 mL，置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入試樣1 mL和25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入8 mmol·L-1鹽酸(HCl)1 mL終止反應，于299 nm處測定吸光度(Ai)，每個試樣做3個平行樣，行統(tǒng)計學處理?？瞻讓φ战M以相同體積純化水代替樣品。清除率(%)=(A0－A樣)/A0×100%。結果見圖4，隨著濃度的增加，草豆蔻總黃酮與茶多酚對超氧陰離子自由基的清除能力也增強，當兩者濃度≥1.0 mg·mL-1時，草豆蔻總黃酮的清除率為79.8%，茶多酚的清除率為80.8%，表明兩者對超氧陰離子自由基的清除能力相近。

2.4 體內抗氧化實驗

2.4.1 造模與給藥將小鼠隨機分成6組，每組6只，分別為正常對照組，衰老模型組，維生素E組，草豆蔻總黃酮低、中、高劑量組。除正常對照組外，其余5組小鼠均按100 mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖造模，正常對照組皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模同時給藥治療，維生素E組按0.05 g·kg-1·d-1灌胃給藥，草豆蔻總黃酮低、中、高劑量組分別按相當于生藥材20，40，60 g·kg-1·d-1灌胃給藥，正常對照組和衰老模型組給予等體積純化水，連續(xù)42 d。

2.4.2 樣品的處理小鼠摘眼球取血，抗凝劑抗凝后2 500 r·min-1離心10 min(離心半徑175 mm)，取上清液冰箱冷藏備用;動物處死后迅速取出肝組織塊，用冰0.9%氯化鈉溶液洗滌除去血液，濾紙拭干，分別稱取0.2～0.3 g加入0.9%氯化鈉溶液(0.9%氯化鈉溶液體積總量是組織塊質量的9倍)，制成10%肝組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑175 mm)，取上清液，置冰箱內冷藏備用。用時稀釋。

2.4.3 主要檢測指標血漿SOD活力及肝勻漿中MDA含量均依據(jù)試劑盒所附方法、步驟進行測定，并計算結果。草豆蔻總黃酮中、高劑量組血漿SOD活性明顯升高(P＜0.01)，肝臟MDA含量顯著降低(P＜0.01)，結果見表1。提示草豆蔻總黃酮在體內具有較好的抗氧化活性。

3 討論

筆者在本實驗中以常用的且具有較強抗氧化能力的茶多酚為對照，考察了草豆蔻總黃酮對羥自由基、脂質過氧化物及超氧陰離子自由基的清除能力，結果提示草豆蔻總黃酮具有較強的抗氧化能力，且抗氧化作用隨濃度的增加逐漸增強。本實驗以SOD及MDA這兩個指標來評價草豆蔻總黃酮體內的抗氧化活性，結果表明其可顯著提高血漿SOD活性，同時降低肝臟中MDA含量，提示其體內具有較好的抗氧化活性。

表1 6組小鼠血清SOD活性及肝臟MDA含量測定結果Tab.1Effects of the total flavonoids from Alpinia katsumadai Hayata and tea polyphenols on the serum levels of SOD activity and MDA content in liver homogenate of aging mice in 6 groups±s

表1 6組小鼠血清SOD活性及肝臟MDA含量測定結果Tab.1Effects of the total flavonoids from Alpinia katsumadai Hayata and tea polyphenols on the serum levels of SOD activity and MDA content in liver homogenate of aging mice in 6 groups±s

與衰老模型組比較，*1P＜0.01，*2P＜0.05Compared with aging model group，*1P＜0.01，*2P＜0.05

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黃酮類化合物主要通過酚羥基與自由基進行抽氫反應生成穩(wěn)定的半醌自由基，從而中斷鏈式反應，達到抗氧化作用，且高效低毒[8]。本研究提示草豆蔻總黃酮具有較強的抗氧化活性，但其活性成分有待進一步研究。

[1]金宏，趙文英，公衍玲.草豆蔻的質量標準研究[J].醫(yī)藥導報，2009，28(3):354－356.

[2]李元圓，桂新，楊莉，等.草豆蔻藥材質量控制方法研究[J].中國中藥雜志，2010，35(16):2091－2094.

[3]畢培曦，江潤祥，吳德鄰.姜科藥用植物的化學、藥理和經(jīng)濟用途-(五)草豆蔻[J].中藥材，1999，11(6):44－45.

[4]王秀芹，李教社，楊孝江，等.草豆蔻中山姜素和小豆蔻明提取工藝的優(yōu)選[J].中藥材，2005，28(4):338－339.

[5]CHANG W C，SEI C K，SOON S H，et al.Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison[J].Plant Science，2002，163(6):1161－1168.

[6]項明志，劉紅梅，貝玉祥，等.訶子多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30(2):46.

[7]單承鶯，任紅榮，何海玲，等.毛膠蕷多糖的體外抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(12):86－89.

[8]張東慶，吳守林，張麗表，等.植物黃酮在抑制亞硝化反應中的應用[J].醫(yī)藥導報，2009，28(6):733－734.