陳玉燕，謝杰斌，陳榮，葉樂馳

（溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325000）

結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和造成的死亡人數在亞洲大幅增加，尤其是在我國[1]，位居癌癥相關性死因的第四、第五位，其轉移是造成患者死亡的主要原因。越來越多的證據支持核轉錄因子（nuclear factor of kappa，NF-κB）在腫瘤發(fā)生、浸潤和轉移中起重要作用。同時也有研究表明，基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）啟動子區(qū)存在NF-κB結合位點，NF-κB促進腫瘤轉移可能與上調血管生成因子以及MMPs的表達有關[2]。然而，聯合研究NF-κB、MMP-9與結直腸癌的浸潤轉移的關系鮮見報道。本研究采用免疫組織化學SP法檢測47例結直腸癌患者NF-κB及MMP-9蛋白表達情況，探討兩者與結直腸癌臨床病理特征的關系。

1 材料和方法

1.1 標本來源及分組

1.1.1 結直腸癌組：收集我院2009年5月至2009年10月經手術切除、術中冰凍及術后病理診斷明確的結直腸癌標本47例，所有患者術前均未接受放療、化療或生物治療。其中男34例，女13例；年齡32～84歲，平均年齡62.55歲（中位數63）；腫瘤直徑＜5 cm者23例，5～10 cm者22例，＞10 cm者2例；局部有淋巴結轉移者18例，無轉移者29例；根據UICC結直腸癌TNM分期：0期4例，I期12例，II期14例，III期16例，IV期1例；高分化8例，中分化33例，低分化6例。所有標本經10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.1.2 癌旁組：取上述結直腸癌癌旁腸管組織，距離癌灶最邊緣2 cm，常規(guī)病理證實無腫瘤侵犯。

1.1.3 近端正常組：取上述近端正常腸管組織，距離癌灶最邊緣10 cm以上，常規(guī)病理證實無腫瘤侵犯。

1.2 主要試劑 兔抗人NF-κB P65單克隆抗體（北京中杉）及山羊抗人多克隆MMP-9抗體為美國Santa Cruz公司產品，產品編號分別為：sc-372，sc-6840；兩個SP試劑盒：內包含過氧化氫、封閉用山羊及兔血清、生物素標記的二抗、辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，為福建邁新產品。檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DAB顯色劑、中性樹脂、蘇木素防脫玻片為北京中杉公司產品。酒精、二甲苯等購買于溫州金山公司。

1.3 方法 每個蠟塊4μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化SP二步法檢測，步驟參照試劑盒說明書操作。用PBS做空白對照，已多次檢測為陽性的標本做陽性對照，抗體稀釋濃度為1:100。

1.4 染色結果判斷 根據陽性表達部位的信號強度和細胞數兩種標準進行綜合評分：①依據陽性細胞染色強度判斷：細胞無染色，記0分；細胞染成淺棕色為弱陽性，記1分；細胞染成棕色且無背景著色，或細胞染成深棕色并有淺棕色背景為中等陽性，記2分；細胞染成深棕色且無背景著色為強陽性，記3分。②依據陽性細胞表達數：無陽性細胞表達，記0分；陽性表達細胞數≤25%，記1分；25%＜陽性細胞數＜50%，記2分；陽性表達細胞數≥50%，記3分。最后將兩者評分結果相乘，其乘積結果為：①0分者為陰性表達，最終計為0分；②1分和2分者為弱陽性表達，最終計為1分；③3分和4分者為中等陽性表達，最終計為2分；④6分和9分者為強陽性表達，最終計為3分。最終得分為0分和1分者記為陰性，2分和3分者記為陽性。

1.5 圖像分析 先在光學顯微鏡下觀察免疫組化切片表達情況，然后每張切片隨機選擇5個陽性表達區(qū)域，在400倍視野下，采用Olympus相機在同一個光源、光圈、亮度、色彩飽和度、對比度及關閉白平衡條件下進行拍照，將所得圖片輸入計算機，應用美國Media Cybemetics公司生產的Image-ProPlus（IPP 5.1）圖像分析軟件進行圖像分析。由于平均光密度值（mean optical density，MOD）能代表免疫組化圖片的染色強度，能較為準確地反映陽性產物表達相對濃度；而且MOD在胞漿和胞核染色陽性的免疫組化標本中有較好的重復性[3]，故采用MOD作為測試指標進行定量分析比較。

1.6 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件。NF-κB和MMP-9蛋白分別在結直腸癌組、癌旁組與近端正常組的陽性表達率比較采用Chi-square Test，所有圖像分析結果以±s表示，各指標與臨床病理特征之間的關系采用t檢驗或方差分析，兩指標表達相關性采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB和MMP-9蛋白在結直腸癌組織、癌旁組織及近端組織中的表達情況 NF-κB陽性細胞以胞質中出現棕黃色顆粒為主，部分見于胞核中（見圖1a、b），陰性細胞未見棕黃色顆粒（見圖1c）；MMP-9陽性細胞為胞質中出現棕黃色顆粒（見圖1d、e）。陰性細胞胞質不染色（見圖1f）。NF-κB蛋白在癌組織的陽性表達率為70.2%，明顯高于癌旁組織的29.8%及近端正常腸組織的8.5%（均P＜0.01）；MMP-9蛋白在癌組織的陽性表達率為76.6%，明顯高于癌旁組織的38.3%及近端正常組織的17.0%（均P＜0.01）。見表1。

表1 各組NF-κB和MMP-9蛋白陽性表達結果

2.2 結直腸癌組織中NF-κB和MMP-9蛋白的表達與臨床病理特征的關系 NF-κB蛋白的陽性表達與結直腸癌細胞分化程度、臨床分期及淋巴結轉移有顯著相關（P值分別為0.032、0.01和0.026），而與性別、年齡、腫瘤大小、部位及浸潤深度均無相關性；MMP-9蛋白陽性表達與淋巴結轉移有顯著相關（P=0.034），而與性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤深度、細胞分化程度及臨床分期均無相關性。見表2-3。

圖1 NF-κB和MMP-9在各組織中的表達（SP，×400）

表2 NF-κB蛋白表達水平及其與臨床病理特征的關系

2.3 結直腸癌組織中NF-κB和MMP-9蛋白表達的相關性 結直腸癌中NF-κB與MMP-9蛋白表達呈正相關（r=0.489，P＜0.01）（見表4）。

3 討論

NF-κB是一類重要的核轉錄因子，可以調控細胞的增殖、凋亡、惡性轉化及浸潤和轉移[4]。在正常細胞中，NF-κB主要分布于胞漿中，與其抑制物I-κB相結合，使其滯留在胞漿內呈非活性狀態(tài)，當受到各種因素刺激時（如細胞因子、炎癥因子等），細胞內的NF-κB被激活成為有活性的二聚體形式，轉位到胞核，與靶基因上的κB序列特異結合，啟動相關基因的轉錄，如炎性因子、黏附分子、化學趨化因子、基質金屬蛋白酶，以及多種增殖和凋亡相關基因，NF-κB活性增強，進而使上述基因表達增加，后者促進細胞的惡性轉化和轉移[5]。大量研究都證明了NF-κB的活化與腫瘤惡性潛能有關，現已發(fā)現多種腫瘤組織中有NF-κB的高表達和高活性現象，可通過調控細胞的增殖、分化、凋亡及惡性轉化影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。然而，NF-κB與腫瘤分化、淋巴結轉移、臨床分期等關系上尚存在爭議。本研究通過對47例大腸癌患者NF-κB蛋白的檢測結果表明：NF-κB蛋白在結直腸癌組織的表達明顯高于癌旁組織及近端正常組織（P<0.01），提示NF-κB可能參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展，NF-κB的持續(xù)活化和高表達可能通過抑制細胞凋亡，促進細胞異常增殖等途徑參與結直腸癌的發(fā)生和進展。另外，本實驗的NF-κB與結直腸癌臨床病理因素關系的分析結果顯示，NF-κB與結直腸癌細胞分化程度、臨床分期及淋巴結轉移顯著相關（P<0.05），目前認為的原因可能與其能夠促進與腫瘤浸潤、轉移相關的重要因子如MMP-9、血管生成因子等的表達有關。

表3 MMP-9蛋白表達水平及其與臨床病理特征的關系

表4 結直腸癌組織中NF-κB與MMP-9的相關性檢驗（n=47）

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組與鋅結合的主要分解細胞外基質的蛋白酶，與腫瘤的侵襲和轉移關系十分密切，其中MMP-9又稱明膠酶B，其作用主要是降解明膠、彈性纖維、II、IV、V、VII和X型膠原[7]?，F已發(fā)現在多種惡性腫瘤中存在著MMP-9的高表達，在結直腸癌中，基底膜IV型膠原蛋白的缺失與腫瘤組織MMP-9的活化形式的表達增強有關[8]。有研究表明，MMP-9拮抗劑可以抑制結直腸癌細胞的移行和黏附[9]，從而提示MMP-9能促進結直腸癌細胞的侵襲和轉移。目前，MMP-9在結直腸癌的定位、表達情況及作用尚無定論，有研究認為MMP-9只在結直腸癌組織中表達，也有研究稱非癌組織中亦有表達，更有研究認為MMP-9在結腸炎相關性腸癌中作為一種腫瘤抑制因子起保護作用[10]。但大多數研究認為MMP-9可以刺激腫瘤生長，在大腸癌的進展和轉移過程中起到關鍵的作用[11]。而我們實驗結果顯示：MMP-9蛋白在結直腸癌組織的陽性表達明顯高于癌旁組織及近端正常組織（P<0.01），且MMP-9蛋白的陽性表達與淋巴結轉移有顯著相關（P<0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤深度、細胞分化程度及臨床分期均無相關性，可能與觀察例數較少，標本來源不同及染色方法不同等有關。以上結果說明，MMP-9與結直腸癌的淋巴結轉移有著密切的關系，其機制可能跟MMP-9的降解作用使腫瘤細胞周圍的物理屏障破壞、通過對細胞外基質的改建，促進腫瘤新生血管的形成，進而促進腫瘤細胞的淋巴結轉移等有關。

雖然關于NF-κB與MMP-9蛋白在結直腸癌中的表達情況已有所研究，但聯合研究二者與結直腸癌臨床病理特征的關系，探討其是否共同影響結直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤轉移目前還鮮見報道。有研究表明，NF-κB可以調控人類惡性腫瘤中的MMP-9的表達[12]，它可以影響MMPs表達而調控轉移，MMP-9啟動子區(qū)存在NF-κB結合位點,EB病毒致瘤蛋白LMP-1活化區(qū)CTAR-1和CTAR-2能活化NF-κB而使MMP-9上調[13]。也有學者研究后推測肌醇六磷酸（IP6）通過調控轉錄因子如NF-κB和AP-1從而調節(jié)MMPs的表達[14]。這些研究都說明了NF-κB可能通過上調MMP-9而促進腫瘤的侵襲和轉移。本實驗研究發(fā)現，結直腸癌中NF-κB與MMP-9表達均較癌旁組織和近端正常組織升高，均與結直腸癌的淋巴轉移有顯著相關，且二者表達呈正相關（r=0.489，P＜0.01），提示了NF-κB可能通過上調MMP-9的表達而促進結直腸癌的淋巴轉移，具體機制尚有待進一步研究。

綜上所述，NF-κB和MMP-9的高表達與結直腸癌的淋巴結轉移密切相關，二者在結直腸癌淋巴結轉移中起著重要作用，聯合檢測NF-κB和MMP-9可能為判斷結直腸癌的淋巴結轉移提供新的生物學指標。

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