仝彩玲，吳銀娟，周勇志，曹 杰，李培英，周金林

蟲學重點開放實驗室，上海 200241；

2.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036

萊姆?。↙yme disease）是經(jīng)硬蜱傳播的由若干不同基因型的伯氏疏螺旋體（Borreliaburgdorferi，Bb）引起的一種多個器官系統(tǒng)發(fā)生病理損傷的人獸共患?。?］。1982年，Burgdorferi等首先從萊姆病疫區(qū)的肩突硬蜱中分離出該病病原體，后被命名為伯氏疏螺旋體［2］。該病主要分布于美國、歐洲和亞洲地區(qū)。全球每年發(fā)病30萬人左右，且不斷增長［3］。目前血清學調(diào)查證實我國黑龍江、內(nèi)蒙古、湖北、貴州、吉林、四川、重慶等29個?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）的人群中存在萊姆病的感染；病原學研究證實黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆等19個?。ㄊ?、自治區(qū)）存在萊姆病的自然疫源地［4］。不同性別、年齡及種族的人對萊姆病普遍易感［5］，人感染萊姆病后，主要引起的癥狀是慢性游走性紅斑、萊姆病性關(guān)節(jié)炎、腦炎、心肌炎、慢性肢皮炎等。萊姆病發(fā)展的不同感染階段、不同基因型螺旋體引起的臨床癥狀不同［6］。萊姆病臨床表現(xiàn)多樣，很難僅僅從臨床表現(xiàn)診斷該病，因此實驗室診斷方法成為萊姆病診斷研究的重點。目前，診斷萊姆病的實驗室方法主要是病原體分離培養(yǎng)、免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法。各種方法都存在著一定的優(yōu)勢和不足之處，伯氏疏螺旋體的分離培養(yǎng)條件要求高、時間長；PCR技術(shù)對某些組織和體液的靈敏性低，費用相對高；常規(guī)的免疫血清學診斷方法，以螺旋體全細胞的超聲裂解混合物為抗原，特異性低。另外，由于伯氏疏螺旋體在傳播媒介和宿主中，抗原的表達量是不同的，某些抗原只在受感染的哺乳動物宿主體內(nèi)特定表達的［7］，且萊姆病螺旋體的亞種之間存在抗原差異［8－9］，給萊姆病血清學診斷抗原的篩選帶來了困難。從而使篩選一個特異性強和敏感性高的萊姆病診斷抗原成為萊姆病實驗室診斷研究的一個重點。研究表明［10］在萊姆病螺旋體眾多的蛋白成分中，其外膜的蛋白Flagellin A鞭毛蛋白具有很強的免疫原性，可在感染后最早檢測到其抗體，其編碼基因位于染色體上，在傳代中不易丟失，其異源性較質(zhì)粒編碼的外膜蛋白小，經(jīng)基因核苷酸序列和編碼蛋白的氨基酸序列的比較發(fā)現(xiàn)萊姆病螺旋體鞭毛蛋白同梅毒螺旋體、大腸桿菌的鞭毛蛋白在N、C端有很高的同源性，而在中心區(qū)域則變異較大，該區(qū)域不與梅毒及正常人血清反應(yīng)，可作為萊姆病早期血清學診斷的抗原標志。依據(jù)Flagelline A的這些作為診斷抗原的潛質(zhì)，我們用基因工程的方法獲取螺旋體鞭毛蛋白的特異性區(qū)段的重組“平截型蛋白”，作為萊姆病的診斷抗原。由于動物萊姆病流行學調(diào)查缺少血清學方法，人用萊姆病檢測試劑盒多為國外產(chǎn)品，且價格昂貴。重組伯氏屬螺旋體為中國萊姆病的診斷試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 基因克隆、測序、表達所用的菌株和質(zhì)粒 克隆載體為PGEM－T easy Vector，購自Promega公司；受體菌為E.coliDH5ɑ感受態(tài)細胞，購自天更生化科技有限公司；表達載體為PGEX－4T－1，受體菌為BL21，購自北京天根生物有限公司。

1.2 主要試劑 樹脂型TM基因組DNA快速提取試劑盒、樹脂型質(zhì)粒DNA小量抽取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒、d NTP、瓊脂糖、瓊脂粉均購自上海賽百勝基因技術(shù)有限公司；DNAMarker DL2000、DNAMarker DL15000購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；工具酶、試劑、Premix TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、限制性內(nèi)切酶XhoI、T4DNA連接酶、為Promega公司產(chǎn)品，BSK培養(yǎng)基購自Sigma公司；Goat anti human IgG購自Jackson公司；蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)XOID公司。

1.3 引物合成 根據(jù)已知的BorreliaGarinii株編碼鞭毛蛋白質(zhì)的基因序列（序列號：CP000013.1）。設(shè)計一對引物。編碼鞭毛蛋白的基因全長共1 008 bp，選取自第5′端394－415為引物序列。第783－799為下游引物序列，5′端均加有限制性內(nèi)切酶EcoR I識別的位點，3′端加有限制性內(nèi)切酶x HoI識別的位點。

上游引物∶5′－CGGAATTCCAAATGCACATGTTGTCAAAC－3′

下 游 引 物 ∶ 5′－GGCTCGAGATTTGCTCTTTGATCAC－3′

引物由上海賽百勝基因技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)總體系為25 μL，其中premix TaqDNA酶12.5μL、上游引物1 μL、下游引物1μL，伯氏疏螺旋體基因組DNA模板2μL，水8.5μL。反應(yīng)條件：94℃預變性5 min，94℃45 s，57℃45 s，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。

2 方 法

2.1 螺旋體菌株及培養(yǎng) 伯氏疏螺旋體Borrelia Garinii由本實驗室分離自新疆亞洲璃眼蜱并由本室保存。螺旋體培養(yǎng)條件：BSK培養(yǎng)基，微需氧，32℃，10～14 d，暗視野下可見螺旋體。

2.2 螺旋體DNA的提取 參照賽百盛公司的基因組DNA提取試劑盒使用說明進行。

2.3 目的片段的克隆

2.3.1 PCR產(chǎn)物的純化與PGEM－T easy Vctor載體的連接和轉(zhuǎn)化 PCR產(chǎn)物首先在含有溴化乙錠的1%的瓊脂糖凝膠上電泳，確定目標條帶后在紫外燈下切下目的條帶用柱式DNA瓊脂糖回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后連接到克隆質(zhì)粒載體試劑盒PGEM－T easy，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，轉(zhuǎn)化方法參考天更感受態(tài)細胞的使用說明。涂布于含AMP的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取陽性克隆。

2.3.2 菌落PCR鑒定 用滅菌的干凈牙簽隨機各挑取10個擬為陽性的菌落，接種于一新的Amp的LB固體培養(yǎng)板上，再洗脫于加有20μL無菌水的1.5 m L滅菌離心管中，在沸水中煮10 min，做為PCR的模板，進行PCR，PCR結(jié)果電泳，有目的條帶的為陽性克隆。培養(yǎng)板上的編號與離心管上的編號相一致，培養(yǎng)板在37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

2.3.3 質(zhì)粒酶切鑒定 把經(jīng)過測序證實的陽性單克隆接種到AMP的LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。按樹脂型質(zhì)粒DNA小量抽取試劑盒試劑盒說明書提取質(zhì)粒并純化，再經(jīng)EcoRI、XhoI切割（37℃，3 h），在1% 瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。2.4 目的片段重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將插有目的片段的T－載體經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，將回收的目的片段與經(jīng)Eco RI、XhoI酶切的PGEX－4T－1連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a中，挑取擬陽性克隆，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切及陽性克隆用Sangers雙脫氧核酸末端終止法測序，由上海美季生物技術(shù)有限公司完成，以鑒定陽性克隆。把經(jīng)測序證實的陽性菌落在含有Amp＋的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21受體菌進行表達。

2.5 “平截型”鞭毛蛋白的表達

2.5.1 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL 21（DE3）受體菌，方法同前。

2.5.2 誘導 轉(zhuǎn)化的菌種接種Amp＋LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。菌液按照1∶100的比例重新接種到Amp＋LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3h，待其OD值達到0.6左右加入誘導劑IPTG，使其終濃度為1 mmol/L，經(jīng)37℃200 r/min振搖6～8 h，，分別于1、3、5、7、9 h收集菌液1 m L 13 000 r/min，離心2 min，收集菌體。

2.5.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定 參照標準方法進行。

2.6 “平截型”鞭毛蛋白的純化 利用GST標簽蛋白和固定在Resin的谷胱甘肽特異性相結(jié)合，最后用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶置換出目的蛋白，從而使帶有標簽蛋白的目的蛋白得到純化。培養(yǎng)誘導400 m L的細菌培養(yǎng)液，超聲裂解細胞，離心后取上清液制備純化樣品，進行純化。純化步驟按照說明書方法進行。

2.7 ELISA檢測研究

2.7.1 抗體的制備 400μL螺旋體單克隆培養(yǎng)物腹腔接種25只小白鼠，5只小白鼠作為對照組不接種螺旋體。3 w后小鼠眼球采血，分離陽性血清。

2.7.2 ELISA方法抗原的包被 分別以空載體誘導的GST標簽純化蛋白做陰性對照，PBST溶液做空白對照，純化的重組蛋白做抗原，包被96孔板，4℃，濕盒內(nèi)包被過夜；傾去抗原液，用PBST洗滌3次，每次5 min，紙巾上拍干；加封閉液，200μL/孔，37℃，濕盒內(nèi)封閉1 h；傾去封閉液，用PBST洗滌，方法同上；制備好的抗血清按一定濃度倍比稀釋后，100μL/孔加入96孔板中，37℃作用2 h；加入100 μL按一定濃度稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗。37℃溫育10 min；傾去二抗，用PBST洗滌，方法同上；加入底物ABTS避光，37℃避光溫育，半小時內(nèi)用酶標儀在波長410 nm處測OD值。

2.7.3 結(jié)果判定 依次測得各反應(yīng)孔OD值，取復孔的OD平均值，P是小鼠接種螺旋體后采集的陽性血清的OD平均值，N是陰性復孔的OD平均值，計算同一工作條件下，P/N值，當P/N值大于等于2為陽性結(jié)果，小于2為陰性結(jié)果。

3 結(jié) 果

3.1 目的基因的擴增與鑒定 PCR擴增出的基因片段，分子量大小約421 bp，符合預期值（結(jié)果見圖1）。將此片段克隆入T載體，經(jīng)藍白斑、菌落PCR及質(zhì)粒酶切鑒定，可篩出陽性克隆，酶切鑒定結(jié)果見圖2。

3.2 目的基因表達載體的構(gòu)建與鑒定 克隆有目的基因的T－載體用EcoRI、XhoI切下的目的基因克隆入PGEX－4T－1，轉(zhuǎn)化入BL21受體菌，挑取10個克隆做菌落PCR，有8個陽性轉(zhuǎn)化率80%。取陽性克隆做質(zhì)粒的酶切鑒定，經(jīng)EcoR I、XhoI酶切后，可見從重組的PGEX－4T－1切下一片段，與原始PCR產(chǎn)物長度一致，約421 bp（見圖3）。通過以上結(jié)果證實，目的基因表達載體構(gòu)建成功。

圖3 重組表達載體的質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果分析M1：DNA Marker 15000；1：重組表達質(zhì)粒酶切；M2：DNA Marker 2000；2：鞭毛蛋白保守區(qū)段基因PCRFig.3 Identification of the recombinant expressed plasmid M1：DNA marker 15000；1：restriction digestion of recombinant expressed vector；2：target gene size；M2：DNA marker 2000

3.3 “平截型”鞭毛蛋白表達、鑒定與復性 將陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）受體菌，BL21（DE3）為溶原菌，帶有SP6、T7強啟動子，故用IPTG誘導目的基因的表達。挑取陽性克隆誘導后經(jīng)SDS－PAGE電泳，可見有表達的蛋白帶（分子量介于45～50 k D），未誘導者無此帶，同時可見空白載體轉(zhuǎn)化的BL21（DE3）經(jīng)誘導后有一條26 k D的表達帶，此蛋白為標簽蛋白表達產(chǎn)物。根據(jù)計算，目的基因與標簽蛋白表達的融合蛋白的分子量應(yīng)為40 k D左右，電泳結(jié)果如圖4。誘導結(jié)果表明，在細菌培養(yǎng)至OD值0.4～0.6時，加IPTG誘導7 h后蛋白表達量較大。以包涵體和可溶性2種形式存在于受體菌內(nèi)，蛋白在以包涵體為主要的表達形式，可溶性蛋白也有小量表達。

3.4 ELISA結(jié)果 取400μL螺旋體單克隆培養(yǎng)物腹腔接種25只小白鼠，5只小白鼠作為對照組不接種螺旋體。3 w后小鼠眼球采血，25只感染動物的血清作為一抗，測得的ELISA試驗結(jié)果OD值平均數(shù)作為其陽性血清的OD值；5只未感染動物的血清作為一抗，測得的ELISA試驗結(jié)果的OD值平均數(shù)作為陰性血清OD值，結(jié)果見圖6，從圖6可以看出，陽性血清與重組蛋白反應(yīng)，其OD值－空白對照OD值/陰性血清OD值－空白對照OD值＞2，可明顯區(qū)分出陰性和陽性樣品，同時GST標簽蛋白不與陽性血清發(fā)生較強的反應(yīng)，同時不影響檢測結(jié)果。

4 討 論

選擇萊姆病螺旋體鞭毛基因的中央?yún)^(qū)段作為血清學檢測萊姆病的抗原有以下幾個方面的優(yōu)點：1.由于編碼鞭毛蛋白的基因位于螺旋體染色體上，較編碼在質(zhì)粒上的蛋白相對穩(wěn)定；2.萊姆病螺旋體鞭毛蛋白的中心區(qū)段是其種內(nèi)的保守區(qū)域，在萊姆病螺旋體種屬內(nèi)不同地理株高度同源（99%左右）；3.機體感染后，此抗原特異性的抗體出現(xiàn)最早，故是理想的全抗原替代者。另外，DNA序列分析表明，Bb與其它種屬菌如梅毒螺旋體的同源性主要集中在氨基端與羧基端。其氨基端（1－137）與梅毒螺旋體同源性為52%，羧基端（262－366）為54%，而中央?yún)^(qū)段（137－262）僅13%。X－射線衍射分析結(jié)果顯示［11］，在鞭毛蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，其氨基端與羧基端位于蛋白的疏水內(nèi)核，而中央?yún)^(qū)段則構(gòu)成蛋白質(zhì)的外表面，在免疫應(yīng)答過程中起重要作用，其氨基端與羧基端則在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的空間構(gòu)象上起重要作用。各國學者對鞭毛蛋白的各區(qū)段的抗原特異性的研究結(jié)果驗證了這一結(jié)論。如Robinson［12］發(fā)現(xiàn)P137－262不與梅毒病人血清和正常人血清起反應(yīng)，P64－311則有微小的交叉反應(yīng)性，而54% 的梅毒病人血清及17% 的正常人血清與全區(qū)段抗原起反應(yīng)，氨基端與羧基端區(qū)段與梅毒病人血清的反應(yīng)性則分別為46% 和15%。Berland［9］發(fā)現(xiàn)P165—261、P197—241、P197—273 3個區(qū)段（位于鞭毛蛋白的中央?yún)^(qū)域）與萊姆病病人血清的反應(yīng)性強于2個末端的各區(qū)段，稍差于全區(qū)段。由以上可見用伯氏疏螺旋體平截性鞭毛蛋白做為ELSIA診斷抗原用于萊姆病的診斷有較強的臨床應(yīng)用價值。有人對伯氏疏螺旋體鞭毛蛋白特異性區(qū)段的基因克隆和表達研究進行報道，如：李新民等作者的伯氏疏螺旋體鞭毛蛋白特異性區(qū)段的克隆和表達［13］，相比于本文，本文的目的和側(cè)重點在于伯氏疏螺旋體平截性鞭毛蛋白在臨床診斷應(yīng)用性的探索，其克隆和表達有更進一步的臨床應(yīng)用價值。該文為萊姆病臨床診斷試劑盒的開發(fā)提供可行性借鑒。

本試驗把加入酶切位點的基因連接到T載體后，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行酶切，回收目的基因連接到表達質(zhì)粒，這樣避免了酶切不完全產(chǎn)物的產(chǎn)生，有利于試驗順利進行。

我們根據(jù)以上的研究結(jié)果，用基因工程的方法獲得131－266氨基酸殘基區(qū)段，能減少全抗原引起的交叉反應(yīng)，提高了萊姆病診斷的特異性，證實了伯氏疏落旋體重組鞭毛蛋白是萊姆病診斷的優(yōu)良候選抗原。

［1］仝彩玲，李培英，周金林.萊姆病診斷技術(shù)研究進展［J］.中國動物傳染病學報，2009，17（3）：76.

［2］Steere AC，Malawista SE，Snydman DR，et al.Lyme arthritis：anepidemic ofoligoarticular arthritis in children and adults in three conneticut communities［J］.Arthritis Rheum，1977，20（1）：7－11.

［3］Vander FK.Everything you need to know about Lyme disease and other tick－borne disorders ［J］. New York.NY John Wiley＆Sons Inc，1997：20－47

［4］萬康林，張哲夫，張金聲，等.中國20個省、區(qū)、市動物萊姆病初步調(diào)查研究［J］.中國媒介生物學及控制雜志，1998，9 （5）：366－371.

［5］劉敏，王樹聲.萊姆病研究進展［J］.廣西預防醫(yī)學報，2001，7：311－314.

［6］仝彩玲.蜱體伯氏疏螺旋體分離鑒定及萊姆病ELISA檢測方法的建立［M］.安徽：安徽農(nóng)業(yè)大學，2010：3.

［7］Molloy P J，D H Persing，V PBerardi.False－positive results of PCR testing for Lyme disease［J］.Clin Infect Dis，2001，33（3）：412－413.

［8］Das S，Barthold S W，Giles S S，et al.Temporal pattern of Borrelia burgdorferi p21 expression in ticks and the mammalian host［J］.J Clin Investig，1997，99（5）：987－995.

［9］Roessler D，U Hauser，B Wilske.Heterogeneity of Bmp A（P39）among European isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato and influence of interspecies variability on serodiagnosis［J］.J Clin Microbiol，1997，35（11）：2752－2758.

［10］Bruckbauer HR，Preac－Mursic V，F(xiàn)uchs R，et al.Cross－reactive proteins of Borrelia burgdorferi.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1992：224－232.

［11］Namba K.structure of core and central channel bacteria flagella［J］.Nature，1989，342：648.

［12］Robinson，et al.Analysis of Humoral response to the Flageline Protein of Borrelia burgdorferi：Cloneing of Regions Capable of different differentiating Lyme Disease from syphilis.J Cline Microbiology，1993，31：629.

［13］李新民，張啟恩，張泮河，等，伯氏疏螺旋體鞭毛蛋白特異性區(qū)段的基因克隆和表達［J］.中國人獸共患病雜志，1999，15（4）：24－26.