李 軍，禤雄標，謝宇舟，謝永平，彭 昊，陳澤祥，胡 帥，馬春霞，楊 威，許力干，潘 艷

大腸桿菌O157∶H7（E.coliOl57：H7）是一種與公共衛(wèi)生密切相關(guān)的腸出血性大腸桿菌血清型，感染后可引起動物腹瀉、出血性結(jié)腸炎，溶血性尿毒綜合癥及血栓性血小板減少等，嚴重者可導致死亡。1982年大腸桿菌O157∶H7在美國首次被確認為食物中毒新型致病菌，現(xiàn)已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題，引起全世界廣泛的關(guān)注［1］。1986年我國首次發(fā)現(xiàn)由大腸桿菌O157∶H7引起的散發(fā)感染，隨后的檢測表明該菌廣泛地分布于我國各地區(qū)［2－4］。大腸桿菌O157∶H7作為一種人獸共患病原菌，可以在畜禽中流行和傳播，并通過動物源性食品傳染給人，目前已有眾多種動物和動物源性食品分離出大腸桿菌 O157∶H7的報道［5－6］。王紅等（2005）［7］在2002－2004年對廣西食品中大腸桿菌O157∶H7的監(jiān)測結(jié)果顯示從市售生牛肉和生豬肉中檢測到大腸桿菌O157∶H7。廣西是農(nóng)業(yè)大省，省內(nèi)有較多的畜禽養(yǎng)殖場，對畜禽大腸桿菌O157∶H7進行流行病學調(diào)查，了解其致病性和耐藥情況，有助于控制大腸桿菌O157∶H7在畜禽中的流行和傳播，防止其經(jīng)動物源性食品在人間傳播。為此，本研究對廣西13個市41個縣（區(qū)）200多個養(yǎng)殖場進行大腸桿菌O157∶H7流行病學調(diào)查，采集2 915份樣本進行大腸桿菌O157∶H7的分離鑒定和生物學特性研究，獲得的廣西大腸桿菌O157∶H7流行病學信息將對預防和控制廣西大腸桿菌O157∶H7在畜禽中的流行和傳播具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、山梨醇麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司，新生霉素EC肉湯、O157顯色培養(yǎng)基購自鄭州安圖生物工程有限公司，兔血瓊脂培養(yǎng)基為本實驗室自制。O157和H7單因子血清購自浙江寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。PCRTaqMix、DNA Marker 1購自廣東東盛生物科技有限公司；微量生化鑒定管和藥物敏感試驗紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。PCR儀購自日本Ta KaRa公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Alpha Inotech公司。

1.1.2 實驗動物 健康昆明小白鼠（20 g/只左右），購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查方法 2007年1月至2010年9月，對廣西南寧、桂林、賀州、柳州、梧州、來賓、玉林、貴港、欽州、防城港市、北海、河池、崇左13個市41個縣（區(qū)）200多個養(yǎng)豬、養(yǎng)雞、養(yǎng)鴨場和養(yǎng)牛場采取詢問、現(xiàn)場調(diào)查、臨床觀察、實驗室檢查和數(shù)據(jù)統(tǒng)計等方法，進行畜禽大腸桿菌O157∶H7的流行病學調(diào)查。共采集畜禽糞便樣本2 915份，其中豬985份，雞772份，鴨718份，牛440份。

1.2.2 細菌分離 將采集的畜禽糞便樣本用無菌PBS稀釋，800 r/min離心5 min，取上清接種于新生霉素EC肉湯，37℃培養(yǎng)6 h后劃線接種到O157顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h。

1.2.3 細菌形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察 取O157顯色培養(yǎng)基37℃18 h培養(yǎng)形成的紫色菌落涂片，革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)和染色特征。同時將該菌分別接種于營養(yǎng)肉湯、兔血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、山梨醇麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察其培養(yǎng)特性。

1.2.4 生化特性 將細菌接種于微量生化管內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24 h，進行細菌的生化特性檢測。

1.2.5 血清型鑒定 應(yīng)用O157和H7單因子血清與待檢細菌在玻片上進行凝集反應(yīng)，測定細菌的血清型。

1.2.6 大腸桿菌O157∶H7的PCR鑒定 采用大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法對待檢細菌進行PCR檢測，確定待檢細菌是否有rfb E（O157）和Flic（H7）基因。引物序列為rfb E－F：5′－TGT CCA TTT ATA CGG ACA TCC ATG－3′；rfb E－R：5′－CCT ATA ACG TCA TGC CAA ATT GCC－3′和Flic－F：5′－GCG AAG TTA AAC ACC ACG AC－3′；Flic－R：5′－ACC CGT ACC AGC AGT AGA TT－3′，擴增片段長度分別為291 bp和180 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.7 致病性試驗 18只健康小白鼠隨機分成6組，每組3只。分離的大腸桿菌O157∶H7在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，調(diào)整細菌濃度為1×1010CFU/m L。試驗組小白鼠腹腔注射相應(yīng)分離株的菌懸液，每只0.3 m L；對照組小白鼠腹腔注射滅菌生理鹽水，每只0.3 m L。每天觀察記錄小白鼠發(fā)病和死亡情況，取死亡小白鼠心、肝和脾等組織作細菌分離鑒定。連續(xù)觀察6 d，第7 d對未死小白鼠進行解剖觀察病變情況。

1.2.8 毒力基因的檢測 針對大腸桿菌O157∶H7的4個毒力基因，溶血素基因（Hly A）、緊密黏附素基因（Eae A）、志賀樣毒素1（Stx1A）、志賀樣毒素2（Stx2A）分別合成引物［8－9］，進行 PCR 擴增，觀察大腸桿菌O157∶H7分離株攜帶毒力基因的情況。1.2.9 藥物敏感試驗 藥敏試驗采用紙片法，將培養(yǎng)好的菌株用生理鹽水稀釋為1×1010CFU/m L后，吸取0.1 m L菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼于平板（6張/板，相隔不少于3 cm），置于5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，用游標卡尺測量抑菌圈大小。

2 結(jié) 果

2.1 廣西大腸桿菌O157∶H7流行病學調(diào)查結(jié)果利用O157顯色培養(yǎng)基對采集的2 915份畜禽糞便樣本進行大腸桿菌O157∶H7的初步分離篩選，分別從3份雞樣本、20份豬樣本和1份牛樣本中分離到24株疑似大腸桿菌O157∶H7菌株，細菌的生化特性和血清凝集反應(yīng)符合大腸桿菌O157∶H7特征。應(yīng)用大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法進行細菌的O157和H7基因鑒定，在檢測的24份疑似樣本中，有5份細菌經(jīng)PCR鑒定為大腸桿菌O157∶H7，樣本細菌分離率為0.17%。這5份細菌來自2009年7月融水縣和防城港市的小規(guī)模豬場腹瀉斷奶仔豬的糞便樣本。使用Flci（H）通用型引物［10］對余下的19株細菌的Flic基因進行擴增、克隆和測序，測序結(jié)果表明這19株細菌的血清型是O157∶H9、O157∶H19、O157∶H25和 O157∶H30。

本次大腸桿菌O157∶H7在畜禽中的流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，大腸桿菌O157∶H7主要在豬流行，當豬群健康時有可能呈隱性感染狀態(tài)，一旦豬處于應(yīng)激狀態(tài)或免疫功能下降時，該菌可大量繁殖，引起斷奶仔豬發(fā)生腹瀉。病豬臨床表現(xiàn)為突然發(fā)生腹瀉，排出灰白色漿狀、糊狀糞便，腥臭，黏膩，腹瀉次數(shù)不等，病程4～5 d，若治療不及時可導致死亡。剖檢尸體外表蒼白、消瘦、腸黏膜有卡他性炎癥變化，腸系膜淋巴結(jié)輕度腫脹。本病發(fā)病季節(jié)主要在夏季。此次調(diào)查數(shù)據(jù)將為廣西獸醫(yī)公共衛(wèi)生防治大腸桿菌O157∶H7提供依據(jù)。

2.2 細菌形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察 大腸桿菌O157∶H7在O157顯色培養(yǎng)基上形成紫紅色菌落，隨著時間延長菌落逐漸變?yōu)樽虾谏?；其他大腸埃希氏菌落為淡粉紅色，腸炎沙門氏菌為淡藍綠色。大腸桿菌O157∶H7在光學顯微鏡下鏡檢為兩端鈍圓的革蘭陰性桿菌；在營養(yǎng)肉湯上無菌膜生成但試管底有粘絲狀沉淀物；在兔血瓊脂培養(yǎng)基上形成白色菌落，中等大小、圓形、稍突起、表面光滑濕潤、邊緣整齊，無溶血；在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落；在山梨醇麥康凱培養(yǎng)基上形成白色半透明菌落；在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成呈黑色帶金屬光澤菌落。

2.3 生化特性 將純化的細菌接種于微量生化管（杭州天和微生物試劑有限公司）內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24 h，細菌的各項生化結(jié)果見表1，與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的大腸桿菌O157∶H7的生化特性相符合［11］。

表1 大腸桿菌O157：H7廣西分離株的生化特性Tab.1 Biochemical characteristics of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi

2.4 血清型鑒定 挑取O157顯色培養(yǎng)基上紫色菌落與大腸桿菌O157和H7單因子血清在玻片上進行凝集反應(yīng)，凝集效價在“＋＋＋”以上的菌落共有24株，將這24株細菌繼續(xù)純化培養(yǎng)，進行PCR鑒定。

2.5 大腸桿菌O157∶H7的基因鑒定 應(yīng)用大腸桿菌O157∶H7雙重PCR方法對細菌進行PCR鑒定，確定細菌是否有rfb E（O157）和Flic（H7）基因。PCR產(chǎn)物電泳顯示在檢測的24份疑似大腸桿菌O157∶H7的DNA中有5份細菌DNA擴增出291 bp和180 bp的目的片段（圖1），表明這5份疑似大腸桿菌O157∶H7細菌含有O157和H7基因，證實為大腸桿菌O157∶H7。

2.6 大腸桿菌O157∶H7分離株的致病性試驗攻毒6 h后，大部分小白鼠精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂、呼吸困難，對刺激反應(yīng)降低。12 h后FC1和RS1菌株引起全部小白鼠死亡，死亡率100%。其余3株細菌在24 h內(nèi)引起部分小白鼠死亡，RS2和FC3菌株對小白鼠的死亡率為66.7%；FC2菌株對小白鼠的死亡率為33.4%。死亡小白鼠病理變化為腸壁菲薄，出血充血、腸腔內(nèi)充滿黃色液體，以十二指腸病變最嚴重；肝臟、心、肺、脾和腎有少量出血點。取死亡小白鼠心血和脾臟劃線培養(yǎng)，均獲得原感染菌株。攻毒后第7 d，攻毒未死小鼠解剖發(fā)現(xiàn)腸壁變薄，內(nèi)含多量氣泡；肝臟表面、心、肺、脾等有不同程度的出血。對照組小白鼠在試驗期間精神、食欲和對條件刺激反應(yīng)都無異常。

圖1 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株的雙重PCR檢測Fig.1 Results of duplex PCR assay of E.coli O157∶H7 strains isolated from GuangxiM：Marker 1；1：RS1；2：RS2；3：FC1；4：FC2；5：FC3

2.7 大腸桿菌O157∶H7分離株的毒力基因檢測5株大腸桿菌O157∶H7廣西分離株毒力基因的PCR檢測結(jié)果表明，5株大腸桿菌O157∶H7攜帶的毒力基因略有差異，具體情況見表2。

表2 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株毒力情況Tab.2 Virulence of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi

2.8 大腸桿菌O157∶H7分離株的藥物敏感試驗

選用氨基糖苷類抗生素、四環(huán)素類抗生素、β－內(nèi)酰胺類抗生素、氟喹諾酮類藥物、磺胺類抗菌藥、多肽類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、林可胺類抗生素、氯霉素類抗生素和利福霉素類抗菌藥共10類26種抗菌藥物對分離得到的5株大腸桿菌O157∶H7進行藥敏試驗，藥敏結(jié)果見表3和表4。

藥敏結(jié)果表明大腸桿菌O157∶H7廣西分離株對阿莫西林、氨芐西林、多粘菌素B、羅紅霉素、利福平和林可霉素不敏感；對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素等氨基糖苷類抗生素、復方新諾明和多西環(huán)素中度敏感；對頭孢西丁、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟等β－內(nèi)酰胺類抗生素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等氟喹諾酮類藥物、和氟苯尼考高度敏感。

3 討 論

家畜家禽是大腸桿菌O157∶H7的主要動物宿主和傳染源［5－6］，本研究對廣西985份豬樣本、772份雞樣本、718份鴨樣本和440份牛樣本進行大腸桿菌O157∶H7的細菌分離和鑒定，最終從5份斷奶腹瀉仔豬的糞便樣本中分離鑒定出大腸桿菌O157∶H7，樣本細菌分離率為0.17%。在采集的樣本中以豬的樣本最多，這可能是導致大腸桿菌O157∶H7都分離自豬樣本的主要原因。雖然未能從雞、鴨和牛的樣本中檢出大腸桿菌O157∶H7，但不代表廣西的雞、鴨和牛未攜帶大腸桿菌O157∶H7，在今后仍需繼續(xù)加強對雞、鴨、牛攜帶大腸桿菌O157∶H7的監(jiān)測。

傳統(tǒng)的大腸桿菌O157∶H7分離鑒定方法是將待檢樣本接種到山梨醇麥康凱培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，再挑取培養(yǎng)基上白色半透明菌落進行O157和H7單因子血清凝集反應(yīng)。由于赫爾曼埃希菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9血清型、N群沙門氏菌、弗勞地和塞氏枸櫞酸桿菌、流產(chǎn)布魯氏菌、大腸桿菌O157非H7血清型細菌和大腸桿菌O157∶H7的菌體脂多糖的O特異性多糖都含有同樣的4－氨基－4，6雙脫氫－α－D甘露糖殘基，在使用山梨醇麥康凱培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時都不能利用培養(yǎng)基的山梨醇，形成的菌落為白色，在形態(tài)上不能和大腸桿菌O157∶H7區(qū)別［12］。流產(chǎn)布魯氏菌、大腸桿菌O157非H7血清型細菌與O157∶H7存在著部分相同的抗原，在進行單因子血清凝集試驗時，會出現(xiàn)交叉反應(yīng)［13］，從而影響結(jié)果的判定。因此使用山梨醇麥康凱培養(yǎng)基和血清凝集反應(yīng)不能正確鑒定大腸桿菌O157∶H7，必須應(yīng)用PCR技術(shù)對其基因進行鑒定。

表3 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株藥敏試驗結(jié)果Tab.3 Drug susceptibility test of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi）

表4 大腸桿菌O157∶H7廣西分離株對抗菌藥物的耐藥率Tab.4 Drug resistance rate of E.coli O157∶H7 strains isolated from Guangxi

大腸桿菌的緊密黏附素介導大腸桿菌與宿主上皮細胞的緊密黏附，是細菌表現(xiàn)其毒性所必需的［14］。志賀樣毒素分為志賀樣毒素1和志賀樣毒素2，它不僅有助于細菌對細胞的黏附和定植，還具有RNA N－糖苷酶作用，可特異性裂解細胞28S r RNA，導致細胞蛋白合成受阻，腸黏膜和血管內(nèi)皮細胞破壞，引起血液釋放到腸腔。多數(shù)情況下，只產(chǎn)生志賀樣毒素2的菌株毒力較只產(chǎn)生賀樣毒素1或產(chǎn)生志賀樣毒素1和志賀樣毒素2混合型的菌株強［15－16］。在本研究中，有2株分離株攜帶緊密黏附素基因和志賀樣毒素2基因；有3株分離株攜帶了緊密黏附素基因、志賀樣毒素1基因和志賀樣毒素2基因。分離株對小白鼠的致病性試驗表明分離株攜帶的毒力基因與其對小白鼠的致死率存在著一定的相關(guān)性。

本研究分離的大腸桿菌O157∶H7菌株對目前獸醫(yī)臨床上常用的一些抗菌藥物不敏感，如阿莫西林、氨芐西林、多粘菌素B、羅紅霉素、利福平和林可霉素；甚至是在同一豬場分離的不同菌株，對同一藥物的敏感性也有差異。分離菌株多重耐藥性的出現(xiàn)是獸醫(yī)臨床上濫用抗菌藥物的結(jié)果，由于細菌耐藥性可以水平傳播，因此，應(yīng)加強普及基層獸醫(yī)人員的藥物應(yīng)用知識，避免長期單一使用藥物或低劑量使用，防止耐藥細菌的產(chǎn)生和擴大。

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