李超偉，黃 進(jìn)，魏蘭英，姜昌富

膠 體 金 免 疫 層 析 技 術(shù) （colloid gold－immunochromatography assay，GICA）和磁微粒酶聯(lián)免疫技 術(shù) （magnetic particle antibody immunoassay，MPAIA）近年來被研發(fā)為日本血吸蟲病診斷試劑，用于檢測日本血吸蟲病血清中特異性抗體［1－4］。為探索2種診斷試劑在檢測人體日本血吸蟲抗體中最佳應(yīng)用范圍與方向，本研究采用膠體金標(biāo)記葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）作為顯色劑代替酶標(biāo)二抗顯色系統(tǒng)、兔抗SPA抗體代替Ig作為質(zhì)控線，制備SPA金標(biāo)試紙條，并評(píng)價(jià)其與MPAIA試劑盒的應(yīng)用效果，分析其各自優(yōu)缺點(diǎn)，為日本血吸蟲病血清抗體檢測試劑的選擇提供客觀依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 SPA金標(biāo)試紙為北京中生朗捷生物技術(shù)有限公司試生產(chǎn)產(chǎn)品（20101119），其研發(fā)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系完成；日本血吸蟲抗體檢測試劑盒（MPAIA）及其檢測儀器由北京倍愛康生物技術(shù)有限公司提供（20100925）。

1.2 血清標(biāo)本 日本血吸蟲病患者血清376例（急性感染67例，慢性感染309例，病原學(xué)檢測均為陽性），肺吸蟲病患者血清、囊蟲病患者血清、旋毛蟲病患者血清、肝吸蟲病患者血清各30例（病原學(xué)檢測均為陽性，且來自非日本血吸蟲病流行疫區(qū)），以上血清均來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系寄生蟲病血清庫；100例健康人血清采自華中科技大學(xué)2010級(jí)大一新生（均來自非日本血吸蟲病流行疫區(qū)）。

1.3 血清檢測及結(jié)果判定方法

1.3.1 SPA金標(biāo)試紙 將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（soluble egg antigen ofSchistosomajaponica，Sj－SEA）、兔抗SPA抗體分別作為試紙檢測線及質(zhì)控線點(diǎn)樣，并與SPA金標(biāo)結(jié)合墊相黏貼，密封保存，以備檢測使用。取10μL血清樣本、90μL含0.5‰tween－20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）至試紙加樣孔處，可見混合后血清及緩沖液因吸附作用沿試紙擴(kuò)散，發(fā)生免疫反應(yīng)，10 min內(nèi)觀察結(jié)果。

質(zhì)控線及檢測線均出現(xiàn)紅色條帶，表明該樣本日本血吸蟲病血清抗體為陽性；僅質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，表明該樣本日本血吸蟲病血清抗體為陰性；質(zhì)控線無紅色條帶或色帶模糊不清表明實(shí)驗(yàn)失敗，需重新檢測。

1.3.2 MPAIA試劑盒 檢測及結(jié)果判定參照試劑盒說明書。取1∶200稀釋的待測血清標(biāo)本15 μL、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Sj－SEA反應(yīng)試劑30μL加入試管中，振蕩混勻后（37±0.5）℃水浴15 min，形成抗體、抗原免疫復(fù)合物。加磁分離試劑60μL至試管中，振蕩混勻后靜置5 min，使磁微粒與上述免疫復(fù)合物相結(jié)合。將試管架緊扣于磁分離板上靜置2 min，棄去上清。各試管添加300μL清洗液，振蕩混勻，此步須重復(fù)2次。各試管加入60μL堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記的羊抗人IgG試劑，振蕩混勻后（37±0.5）℃水浴15 min。再次將試管架緊扣放磁分離板上靜置2 min，棄去上清，并重復(fù)清洗2遍。各試管中加入100μL含有單磷酸酚酞的溶液，振蕩混勻后（37±0.5）℃水浴15 min。各試管中加入300μL終止液，振蕩混勻后緊扣于磁分離板上10 min，用磁分離免疫測定儀讀取吸光度（A550）值。

MPAIA試劑盒臨界值為0.811，大于或等于臨界值為陽性，小于臨界值為陰性。

1.4 效果評(píng)價(jià)

1.4.1 使用SPA金標(biāo)試紙和MPAIA試劑盒檢測日本血吸蟲病患者血清及健康人血清 根據(jù)表1所列檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析模式，計(jì)算兩種診斷試劑的靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)等指標(biāo)，從真實(shí)性、可靠性及等效性等方面進(jìn)行應(yīng)用效果的評(píng)價(jià)。

表1 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Table for the results of the detection

（1）靈敏度（%）＝A/（A＋C）×100，反映該方法找出病人的能力。其值愈大則漏診的可能性愈小。

（2）特異度（%）＝D/（B＋D）×100，反映該方法正確排除患病的能力。其值愈大則誤診的可能性愈小。

（3）符合率（%）＝ （A＋D）/（A＋B＋C＋D）×100，又稱一致性。

（4）陽性預(yù)測值（%）＝A/（A＋B）×100，又稱預(yù)測陽性結(jié)果的正確率。表明在試驗(yàn)結(jié)果為陽性的人中，患該病的概率。

（5）陰性預(yù)測值（%）＝D/（C＋D）×100，又稱預(yù)測陰性結(jié)果的正確率。表明在試驗(yàn)結(jié)果為陰性的人當(dāng)中，能排除該病的概率。

（6）約登指數(shù)＝（靈敏度＋特異度）－1，又稱正確指數(shù)。表明該試劑發(fā)現(xiàn)真正病人與非病人的總能力，指數(shù)越大，真實(shí)性越高。

1.4.2 使用SPA金標(biāo)試紙和MPAIA試劑盒同步檢測所有日本血吸蟲病患者血清、健康人血清及4種蠕蟲病患者血清。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，分析比較兩試劑。

2 結(jié) 果

2.1 SPA金標(biāo)試紙檢測和 MPAIA試劑盒檢測376例日本血吸蟲病患者血清及100例健康人血清，急性感染患者血清檢出率均為100%（67/67），見表2。

2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo) SPA金標(biāo)試紙和MPAIA試劑盒的靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)見表3。

2.3 2試劑同步檢測所有日本血吸蟲病患者血清、健康人血清及4種蠕蟲病患者血清，檢測結(jié)果見表4。

表2 SPA金標(biāo)試紙和MPAIA試劑盒檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Table for the results of the detection by colloidal gold－SPA strip and MPAIA kit

表3 SPA金標(biāo)試紙和MPAIA試劑盒臨床指標(biāo)Tab.3 Clinical indicators of colloidal gold－SPA strip and MPAIA kit

表4 SPA金標(biāo)試紙與MPAIA試劑盒檢測結(jié)果的比較Tab.4 Comparisons of the detection by colloidal gold－SPA strip and MPAIA kit

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，2種試劑檢測日本血吸蟲病患者血清，其結(jié)果差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意（χ2＝2.23，P＞0.05）；2法檢測健康人血清，其結(jié)果差別也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0，P＞0.05）；對(duì)于日本血吸蟲病患者血清與健康人血清，2試劑檢測結(jié)果呈高度一致（kappa＝0.88）（表4）。

對(duì)肺吸蟲病患者血清、囊蟲病患者血清、旋毛蟲病患者血清及肝吸蟲病患者血清的檢測，SPA金標(biāo)試紙的總交叉反應(yīng)率為7.5%（9/120），MPAIA 試劑盒僅有2.5%（3/120），詳見表4。

3 討 論

理想的診斷試劑應(yīng)具備靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單快速、便于運(yùn)輸和保存等優(yōu)點(diǎn)，可用于病例診斷或篩查、流行病學(xué)調(diào)查、疾病監(jiān)測以及抗藥性監(jiān)測等［5］。本研究以病原學(xué)檢測作為金標(biāo)準(zhǔn)，收集日本血吸蟲病患者血清、健康人血清、4種常見蠕蟲病患者血清進(jìn)行檢測，以評(píng)價(jià)2種免疫學(xué)診斷試劑的應(yīng)用效果。

MPAIA試劑盒檢測準(zhǔn)確性較強(qiáng)，其檢測結(jié)果的正確率高于SPA金標(biāo)試紙，且漏診及誤診的可能性也少于SPA金標(biāo)試紙；對(duì)于4種常見蠕蟲病的檢測，MPAIA試劑盒交叉反應(yīng)率較低SPA金標(biāo)試紙。但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：兩者對(duì)日本血吸蟲病人血清和健康人血清的靈敏度及特異度差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢測結(jié)果呈高度一致性，可認(rèn)為2種診斷試劑是等效的，皆可作為理想的日本血吸蟲病診斷試劑。下面分別從2種診斷試劑的實(shí)驗(yàn)原理和過程等方面進(jìn)行分析，以評(píng)價(jià)其應(yīng)用于臨床檢測的效果及意義。

SPA金標(biāo)試紙集中了免疫學(xué)反應(yīng)與色譜層析的特點(diǎn)，使待測血清中的日本血吸蟲抗體IgG與金標(biāo)SPA結(jié)合，形成金標(biāo)SPA－IgG復(fù)合物，再與硝酸纖維素膜上的Sj－SEA結(jié)合，實(shí)際上對(duì)被檢測的日本血吸蟲抗體起到了濃縮、聚集作用，從而加快了反應(yīng)速度，整個(gè)操作僅需10 min；金標(biāo)SPA作為橋抗體，無種屬特異性，且具有高度的穩(wěn)定性及活性［6－7］；SPA金標(biāo)試紙可同時(shí)進(jìn)行大批量血清標(biāo)本檢測，無需其他儀器設(shè)備，即可直接判讀結(jié)果，簡單、準(zhǔn)確，且操作簡便、易于保存、價(jià)格低廉，很適合于基層衛(wèi)生單位對(duì)日本血吸蟲抗體進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測和流行病學(xué)調(diào)查［8－9］。為進(jìn)一步滿足臨床需要，制備敏感性更高、適用范圍更廣的SPA以及降低交叉反應(yīng)現(xiàn)象將是其主要研究方向。

MPAIA試劑盒是根據(jù)80年代瑞士Serono診斷中心發(fā)明的一種非同位素免疫檢測技術(shù)研發(fā)的一種日本血吸蟲病診斷試劑。其整個(gè)檢測過程進(jìn)行2步洗滌，并對(duì)血清進(jìn)行稀釋（1∶200），使檢測本底降低；利用磁性分離技術(shù)，使整個(gè)檢測系統(tǒng)靈敏度高、交叉反應(yīng)低、特異度高；試劑盒的酶底物為單磷酸酚酞，呈色穩(wěn)定，結(jié)果可靠；且試劑盒易保存，對(duì)人體無害，無放射性。與病原學(xué)檢測結(jié)果的高符合率及較低的漏診率、誤診率使MPAIA試劑盒很適于臨床檢驗(yàn)，以確診日本血吸蟲病及鑒別診斷其他蠕蟲病。為了使MPAIA試劑盒能更好的滿足臨床多樣化的需求，推廣應(yīng)用于基層及現(xiàn)場篩查，優(yōu)化反應(yīng)體系、降低成本、提高反應(yīng)速度將是其以后長期的研究方向。

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