鞏天祥,馮 偉,李婉宜,張 強,戴 軍,裴德翠,蔣忠華,李明遠

2.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院微生物學教研室,成都 610041

小鼠β防御素2在MDCK細胞中的表達和抗流感病毒活性研究*

鞏天祥1,馮 偉1,李婉宜2,張 強2,戴 軍2,裴德翠2,蔣忠華2,李明遠2

目的探索小鼠β防御素2(mouse β-defensin 2,mBD2)表達載體在狗腎傳代細胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)中的表達和抗甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)活性。方法將真核表達載體pcDNA3.1/mBD2利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染MDCK細胞,G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細胞,用RT-PCR方法鑒定目的基因和免疫熒光法鑒定目的蛋白在轉(zhuǎn)染細胞中的表達。用TCID50測定轉(zhuǎn)染細胞的抗IAV活性。用pcDNA3.1/mBD2質(zhì)粒免疫小鼠,觀察死亡保護率。結(jié)果pcDNA 3.1/mBD2轉(zhuǎn)染MDCK細胞后在細胞中穩(wěn)定表達,轉(zhuǎn)染細胞的TCID50比對照組的病毒效價降低近77.98倍;重組質(zhì)粒免疫小鼠后,死亡保護率為55.55%。結(jié)論mBD2能夠在MDCK細胞中穩(wěn)定表達,并且在體外及體內(nèi)實驗中顯示出抗流感病毒活性,該結(jié)果為抗流感病毒制劑研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

小鼠β防御素2;表達載體;甲型流感病毒

防御素是一類富含半胱氨酸的內(nèi)源性抗微生物多肽(anti-microbe peptide,AMP)。根據(jù)二硫鍵的位置和空間結(jié)構(gòu)的不同,哺乳動物防御素可以分為3類 :α-防御素 ,β-防御素和 θ-防御素[1]。β-防御素(β-defensin,BD)為固有或誘導性表達的多肽,主要由皮膚,支氣管和泌尿生殖道上皮細胞所分泌。它們具有廣譜抗微生物活性,對細菌,真菌及包膜病毒具有很強的殺傷活性[2],而且具有抗腫瘤細胞活性[3]。它在局部粘膜免疫中發(fā)揮重要作用,構(gòu)成機體抵御外界病原微生物入侵的第一道防線。因此,被認為是新型抗生素的理想替代品。

流行性感冒(流感)多數(shù)是由甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)引起的急性呼吸道傳染病,以其病原體的高變異性,感染人數(shù)龐大和傳播速度快為特征。目前防治流感的主要手段為疫苗和化學藥物,雖然現(xiàn)在廣泛使用的滅活流感疫苗在同型免疫的情況下,對健康成年人有很好的保護作用,但是流感的高變異特性使疫苗預防效果不盡人意。耐藥毒株的不斷出現(xiàn)[4]使我們有必要尋求新型的抗流感制劑,而β-防御素以其獨特的抗微生物作用方式有望成為理想的抗流感病毒的候選藥物之一?，F(xiàn)有的研究已證明不同的防御素有不同的抗微生物譜,本研究旨在探索小鼠β-防御素2(mBD2)的抗流感病毒活性,為防御素的應用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒,細胞株,病毒株及小鼠 真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/mBD2由美國NIH楊德博士惠贈;空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞MDCK-pcDNA3.1細胞由本實驗室保存;MDCK傳代細胞系甘肅省疾病預防控制中心李紅育老師惠贈;甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)為本實驗室保存;4～6周齡BALB/c雌性小鼠購自于四川大學華西醫(yī)學實驗動物中心。

1.1.2 試劑 細胞培養(yǎng)基DMEM為Gibco公司產(chǎn)品;小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;真核轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司;TRIZOL為Invitroge公司產(chǎn)品;兩步法RT-PCR試劑盒和PCR master mix為Fermentas公司產(chǎn)品;引物合成由上海英駿公司完成;質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A Plasmid Mininprep KitⅠ為Omega公司產(chǎn)品;FITC熒光標記二抗和封閉血清為北京中山金橋公司產(chǎn)品;羊抗鼠mBD2多克隆抗體購自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 MDCK細胞培養(yǎng) 按文獻[5]所述方法進行。

1.2.2 質(zhì)粒提取 將含pcDNA3.1/mBD2質(zhì)粒的JM109甘油菌劃線接種于含100 μ g/mL Amp的LB平板上,置37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜;次日取出,挑取單個菌落,接種于5 mL含 100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,按試劑盒E.Z.N.A Plasmid Mininprep KitⅠ操作說明書進行質(zhì)粒提取。

1.2.3 轉(zhuǎn)染 分兩個實驗組,轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/mBD2的實驗組和不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MDCK細胞對照組;每組設(shè)立3個復孔。待6孔培養(yǎng)板中的MDCK細胞生長成單層后,按 LipofectamineTM2000(LF2000)轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.4 轉(zhuǎn)染細胞的穩(wěn)定篩選 轉(zhuǎn)染后48h,在轉(zhuǎn)染孔內(nèi)加入預實驗篩選最佳濃度的G418,即100 mg/L進行篩選。將篩選出的陽性細胞克隆轉(zhuǎn)種至細胞培養(yǎng)瓶中進行擴增培養(yǎng)以獲得足量穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,命名為MDCK-pcDNA3.1/mBD2。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細胞的鑒定

1.2.5.1 RT-PCR鑒定 根據(jù)mBD2成熟肽全序列(GenBank登錄號為AJ011800),設(shè)計擴增上游引物為 5′-GCAGAACTTGACCACTG-3′,下游引物為 5′-TCAT TTCATGTACT TGCAACAGG-3′,擴增產(chǎn)物長度為126 bp。提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDCK細胞和未轉(zhuǎn)染的MDCK細胞mRNA為模板進行RTPCR擴增。PCR擴增條件為:94℃預變性4 min;94℃變性30 s;60℃退火30 s;72℃延伸30 s;共30個循環(huán),72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中分析結(jié)果。

1.2.5.2 免疫熒光檢測鑒定 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細胞以及未做轉(zhuǎn)染的MDCK細胞于6孔板內(nèi)做爬片培養(yǎng),4%多聚甲醛固定后用0.5%Triton X-100對細胞打孔,5%的兔血清封閉后滴加1∶100稀釋的羊抗鼠mBD2抗體,4℃孵育過夜,避光滴加1∶200稀釋的FITC標記兔抗羊IgG,用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)mBD2蛋白表達。

1.2.6 抗流感病毒細胞實驗[5]將已在96孔細胞培養(yǎng)板中長成單層的MDCK-pcDNA3.1/mBD2細胞生長液棄去,PBS清洗后分別加入100μ L/孔10-1～10-8倍比稀釋的IAV懸液,每稀釋度設(shè)四個復孔,以未轉(zhuǎn)染的MDCK細胞為對照組。置35℃培養(yǎng)箱吸附1.5 h后棄感染液,PBS清洗后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液置35℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察并記錄細胞病變效應(CPE),按Reed Muench公式計算 TCID50,數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.2.7 抗流感病毒體內(nèi)實驗 按文獻[6]所述堿裂解法提取并純化質(zhì)粒,設(shè)pcDNA3.1/mBD2為實驗組,pcDNA3.1(+)和PBS為對照組,每側(cè)小鼠股四頭肌注射質(zhì)?；?PBS 50 μ g,100 μ g/只 ;間隔 3 周后同劑量加強免疫;于加強免疫后第7d用20×LD50 IAV 25μ L/只滴鼻攻擊小鼠,觀察記錄小鼠的生存和死亡情況至14d,計算死亡保護率。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的鑒定

2.1.1 RT-PCR鑒定 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDCK-pcDNA3.1/mBD2,空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞 MDCK-pcDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的MDCK細胞的RT-PCR結(jié)果顯示:用mBD2特異引物從MDCK-pcDNA3.1/mBD2中擴增得到了120bp左右大小的目的片段(圖1);而從空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞MDCK-pcDNA3.1和MDCK細胞對照中沒有擴增到陽性片段,證實穩(wěn)定篩選得到的MDCK-pcDNA3.1/mBD2細胞株有mBD2基因表達。

圖1 pcDNA3.1/mBD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細胞RT-PCR結(jié)果Fig.1 RT-PCR product amplified from MDCK cells transfected by pcDNA3.1/mBD2 plasmid.

2.1.2 間接免疫熒光鑒定 用mBD2的特異性抗體進行的MDCK-pcDNA3.1/mBD2和MDCK細胞的間接免疫熒光檢測實驗結(jié)果顯示:MDCK-pcDNA3.1/mBD2細胞內(nèi)有明顯的綠色熒光存在(圖2 D),而MDCK細胞未觀察到細胞內(nèi)綠色熒光(圖2 B),表明mBD2蛋白在MDCK-pcDNA3.1/mBD2細胞內(nèi)有表達,表達率接近100%。

圖2 mBD2蛋白在MDCK-pcDNA3.1/mBD2細胞中的穩(wěn)定表達(×200)Fig.2 Stable expression of mBD2 in MDCK-pcDNA3.1/mBD2(×200)

2.2 轉(zhuǎn)染細胞的抗流感病毒活性 IAV感染細胞后引起的CPE為細胞變圓破碎、脫落、形態(tài)皺縮和折光性減弱。以同一流感病毒對 MDCK和MDCK-pcDNA3.1/mBD2兩種細胞的半數(shù)致細胞病變量TCID50效價分別為 4.903(-log10)±0.372和3.011(-log10)±0.459,統(tǒng)計學分析有顯著差異(P＜0.05),而IAV復制數(shù)量減少近77.98倍。

2.3 質(zhì)粒免疫后小鼠的抗流感病毒實驗 用IAV分別攻擊質(zhì)粒pcDNA3.1/mBD2,pcDNA3.1(+)(PBS作為對照)免疫實驗小鼠后,質(zhì)粒pcDNA3.1/mBD2免疫組小鼠有6只存活,空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組小鼠零存活,PBS對照組有1只存活,pcDNA3.1/mBD2免疫組與其它2組的差異有統(tǒng)計學意義(圖3),死亡保護率為55.55%。

圖3 IAV攻擊質(zhì)粒pcDNA3.1/mBD2免疫實驗小鼠的死亡保護率Fig.3 The protection rates of immuned with pcDNA3.1/mBD2 mice challenged with lethal IAV

3 討 論

mBD2在小鼠呼吸道及肺組織中高表達[7],我們推測它在機體抗流感病毒防御中可能扮演重要角色,并對此在體內(nèi)外進行了初步研究。

通過基因工程技術(shù)獲得目的蛋白是目前廣泛采用的方法之一。常用的基因工程表達系統(tǒng)有哺乳動物真核細胞表達系統(tǒng)與原核工程菌表達系統(tǒng)。真核細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)點在于:易于合成,能有效分泌到培養(yǎng)液中;合成方式與天然蛋白相似,因而所合成的蛋白質(zhì)有正確的折疊和二硫鍵空間結(jié)構(gòu),從而避免了被溶酶體降解的可能;能發(fā)生糖基化,前體加工和修飾等從而保證其具有生物學活性[6]。為了探索轉(zhuǎn)基因治療,真核表達通?？勺鳛閯游矬w內(nèi)試驗乃至人體內(nèi)試驗所用,成為對目的基因的表達和所表達蛋白功能研究的一個重要手段。蔡紹輝[8]等將人β-防御素2(hBD2)的cDNA片段插入到帶有報告基因的真核表達質(zhì)粒pCMV.tag 2B中,構(gòu)建了hBD2的重組表達載體pCMV.tag2B/hBD2,通過脂質(zhì)體介導手段將其轉(zhuǎn)染入COS-7細胞中,用RT-PCR和免疫印跡方法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測到被轉(zhuǎn)染細胞能有效表達hBD2。本研究也采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將mBD2成熟肽基因?qū)隡DCK細胞,經(jīng) G418篩選得到穩(wěn)定表達 mBD2的細胞株。MDCK細胞是對流感病毒敏感,目前在流感病毒研究中最常用的傳代細胞株,具有持續(xù)表達外源基因的能力。β-防御素mBD2是誘導性表達[7]的分泌多肽,分泌蛋白(穿過合成所在的細胞而轉(zhuǎn)到其他組織細胞去的蛋白質(zhì))常帶有信號肽,信號肽位于分泌蛋白的N端,它引導分泌蛋白被分泌到胞外[9]。pcDNA3.1/mBD2表達載體中,用基因重組方法將其中用具有明確穿膜功能的小鼠IgG κ鏈的信號肽替代mBD2信號肽基因,形成IgG κ鏈和成熟肽兩個部分的重組防御素基因,以確保目的蛋白表達后分泌至胞外。

本研究中用同一IAV攻擊MDCK-pcDNA3.1/mBD2和MDCK細胞,測定感染后病毒TCID50,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞的明顯低于未轉(zhuǎn)染細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/mBD2免疫小鼠后提高了致死量IAV攻擊動物的生存率,表明mBD2具有抗IAV活性,為進一步探索β防御素的抗流感機制及作為新型抗甲型流感病毒制劑奠定了實驗基礎(chǔ)。防御素抗病毒作用主要針對包膜病毒如IAV,HIV和HSV等[10-12]。它的抗病毒效應通過與病毒包膜的相互作用[10],如封閉病毒與細胞表面結(jié)合受體而阻斷病毒的穿入;刺激宿主細胞內(nèi)靶點使細胞抗病毒蛋白或抑制病毒基因/蛋白表達;β-防御素也可以誘導DNA鏈斷裂損傷[13]而發(fā)揮抗病毒效應。另外,防御素不僅具有直接抗病毒活性,在病原微生物入侵早期即發(fā)揮著防御作用,而且在機體固有免疫系統(tǒng)中,作為固有免疫的主要效應分子,其間接的激活作用為獲得性細胞免疫應答提供了有益的補充[14]。隨著對防御素抗微生物活性及機制研究的深入,它將成為新型抗生素造福人類。

[1]Lehrer RI.Primate defensins[J].Nat Rev Microbiol,2004,2(9):727-738.

[2]Pazgier M,Hoover DM,Yang D,et al.Human beta-defensins[J].Cell M ol Life Sci,2006,63(11):1294-1313.

[3]魏曉麗,李明遠,李虹,等.信號肽重組mBD2在宮頸癌細胞中的穩(wěn)定表達及活性測定 [J].四川大學學報,2007,38(2):222-225.

[4]Le QM,Kiso K,Someya YT,et al.Avian flu:isolation of drugresistant H5N1 virus[J].Science,2005,437:1108.

[5]郭元吉,程曉雯.流行性感冒病毒及其實驗技術(shù)[M].北京:三峽出版社,1997:16-24,100-102.

[6]J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾.分子克隆實驗指南[M].3版.北京:科學出版社,2002:96-99.

[7]Morrison GM,Davidson DJ,Dorin JR.A novel mouse beta defensin,Defb2,which is upregulated in the airways by lipopolysaccharide[J].FEBS Lett,1999,442(1):112-116.

[8]蔡紹輝,杜軍,陳新年,等.重組人β-防御素2基因在COS-7細胞中的轉(zhuǎn)染表達[J].華西醫(yī)科大學學報,2000,31(4):433-37.

[9]楊運桂,徐京寧,胡泰山.信號肽疏水性的提高促進青霉素G?；阜置?[J].生物化學與生物物理學報,2000,32(2):163-165.

[10]Leikina E,Delanoe-Ayari H,Melikov K,et al.Carbohydratebinding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins[J].Nature Immunology,2005,6:995-1001.

[11]Quinones-Mateu ME,Lederman MM,Feng Z,et al.Human epithelial beta-defensins 2 and 3 inhibit HIV-l replication[J].AIDS,2003,17(16):39-48.

[12]Ehsan H,Benjamin G,Wuyuan L,et al.Human α-defensins block multiple steps in herpes simplex virus infection[J].J Immunol,2006,177:8658-8666.

[13]Gera JF,Lichtenstein A.Human neutrophil peptide defensins induce single strand DNA break target cell[J].Cell Immunol,1991,138(1),108-120.

[14]Yang D,Chertov O,Bykovskaia SN,et al.Beta-defensins:linking innate and adapdtive immunity through dendritic and T cell CCR6[J].Science,1999,286(5439):525-528.

Expression on mouse β-defensin 2 in MDCK and its activity against influenza A virus

GONG Tian-xiang,FENG Wei,LI Wan-yi,ZHANG Qiang,DAI Jun,PEI De-cui,JIANG Zhong-hua,LI Ming-yuan
(ChenduBlood Center,Chengdu610041,China)

The objective of this paper is to study the expression of mBD2 in MDCK cell and its activity for against IAV.The established eukaryotic expressing plasmid pcDNA3.1/mBD2 was transfected into MDCK cell by PolyFect transfection Reagent.The positive clone with pcDNA3.1/mBD2 was screening with G418.Expression of target gene and peptide in transfected cells was detected with RT-PCR and the immunofluorescence assays,respectively.The activity of anti-IAV of transfected cells was measured with TCID50.Additionally,pcDNA3.1/mBD2 was injected into mice to observe its effect against IAVin vivo.The results showed that pcDNA3.1/mBD2 plasmid was transfected successfully and expressed stably in MDCK.The TCID50on transfected cells decreased 77.98 times compared with control group,and it had distinct difference between the experiment and control groups(P＜0.05).The protection rate for the mice immuned with pcDNA3.1/mBD2 after challenged with lethal IAV was 55.55%.These results suggested mBD2 has a clear activity for against IAVin vivoandin vitro,and it established a foundation for studying mBD2 against IAV.

mBD2;expression vector;influenza A virus

R373.1

A

1002-2694(2011)09-0792-04

*國家自然科學基金資助項目(30671964)

李明遠,Email:lmy3985@sina.com

1.成都市血液中心血液研究室,成都 610041;

2.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院微生物學教研室,成都 610041

2010-11-09;

2011-04-05