劉海波，孔垂?jié)?/p>

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110001）

許多研究表明，p53蛋白表達是膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的重要因子，p53行使其生物學效應主要通過p53蛋白與特異基因序列結合后，激活下游基因的表達來實現(xiàn)［1］。PIG3為p53誘導基因3（p53 inducible gene 3），是p53的下游基因之一，其基因全長7424 bp，定位于2p23.3，編碼分子量約35kD的蛋白質，其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚不明確。本研究檢測40例膀胱癌標本及15例非腫瘤膀胱組織中PIG3蛋白表達情況，探討其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科患膀胱癌而行膀胱全切或部分切除術的標本40例，及距腫瘤≥3 cm的膀胱組織標本15例為實驗對象。所有標本均得到患者授權。病例組40人，年齡42～87歲，平均年齡59歲，其中臨床分期T118例，T213例，T39例；術后病理分級G119例，G215例，G36例；復發(fā)性膀胱癌7例。對照組15例，年齡54～85歲，平均年齡63歲。手術切取的膀胱標本立即于無菌條件下放入消毒后的Eppendof管內，于液氮中30 min后放入-70℃深低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要藥品、試劑及儀器

藥品及試劑：鼠抗人PIG3單克隆抗體購自美國Oncogene公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG購自美國Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自瑞典Pharmacia公司；硝酸纖維素膜購自美國Bio-rad公司。

實驗儀器：2K15C型低溫超速離心機為美國Sigma公司產品；Chemi Imager 5500電泳凝膠成像系統(tǒng)為美國Alpha公司產品；VC50T型超聲粉碎儀為美國Sonics&Materials公司產品；DIAX900型勻漿機為德國Heidolph公司產品；MultiphorⅡ型電泳儀為瑞典Pharmacia Biotech公司產品；Trans-Blot SD型半干轉膜儀為美國Bio-rad公司產品；UV300型紫外分光光度計為英國Unicam公司產品。

1.3 實驗方法

Western blot方法檢測PIG3蛋白表達。先提取各樣本組織的總蛋白，采用福林-酚法（lowry法）測定蛋白濃度后，煮沸變性5 min后備用。取40 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳（3%濃縮膠，5%分離膠），半干轉膜法轉膜。鼠抗人PIG3單克隆抗體（1∶200）孵育過夜，洗膜，1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG孵育2 h，之后顯色。Chemi Imager 5500電泳凝膠成像系統(tǒng)成像，應用Fluorchem v2.0凝膠成像分析軟件測定各條帶的積分吸光度值，計算各組樣本中PIG3蛋白含量的變化。同樣步驟加入鼠抗人β-actin單克隆抗體，檢測樣品中β-actin的蛋白表達作為內參照。

1.4 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)以±s表示，應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，顯著性檢驗采用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

病例組及對照組均于同一位置（35 kDa）出現(xiàn)單一條帶（圖1）。對照組PIG3蛋白表達積分吸光度值為141.8±11.9；病例組的PIG3蛋白表達積分吸光度值隨病理分級升高而明顯減少，其中G1，G2，G3級PIG3蛋白表達積分吸光度值分別為96.3±8.7，30.7±3.6，19.9±2.9，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；隨臨床分期升高，PIG3蛋白含量亦明顯下降，其中T1與T2+T3組PIG3蛋白表達積分吸光度值分別為 75.4±12.5，32.1±5.4；組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；復發(fā)性膀胱癌PIG3蛋白表達積分吸光度值為42.7±6.2，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組PIG3蛋白表達值見表1。

圖1 膀胱癌組織中表達PI G 3蛋白情況Fig.1 The level of PIG 3 protein in the bladders

表1 病例組及對照組中PI G 3蛋白積分吸光度值Tab.1 The level of PIG 3 protein in the cases

3 討論

野生型p53誘導凋亡的途徑之一，是通過PIG3的激活來促進活性氧簇的產生，進而誘導凋亡［2］。Contente等［3］研究發(fā)現(xiàn)：野生型p53直接而且特異地與PIG3中（TGYCC）15序列反應，PIG3通過野生型p53的過度表達而激活，這種PIG3激活與誘導凋亡之間的關聯(lián)提示PIG3的激活或相似調節(jié)有助于p53介導的細胞凋亡，在p53調節(jié)的生長抑制期間，PIG3水平顯著改變［4］。近來有研究表明PIG3在DNA損傷應答路徑中是一個關鍵因子［5］，在對乳腺癌和肺癌及白血病的研究中發(fā)現(xiàn)了PIG3表達水平的顯著變化［6～8］。突變型p53蛋白高表達多見于高分期及高級別腫瘤，與腫瘤復發(fā)，進展和整體生存時間縮短有關，而p53突變后不能激活PIG3啟動子，也不能誘導凋亡，這提示PIG3可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。

我們的研究結果顯示：各組病理分級及臨床分期的膀胱尿路上皮癌組織中PIG3蛋白表達積分吸光度值與對照組比較，均有明顯差別。隨著病理分級升高，PIG3蛋白表達值明顯降低，對照組與G1、G2、G3級比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示PIG3蛋白表達的多少與膀胱癌的惡性程度有著密切關聯(lián)；隨著臨床分期升高，PIG3蛋白表達呈下降趨勢，對照組與T1組及T2+T3組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明PIG3蛋白表達的多少與膀胱癌的浸潤及進展程度有著緊密聯(lián)系。以上結果也證實了PIG3蛋白在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及預后判斷中有著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)：復發(fā)性膀胱癌患者的PIG3蛋白表達水平較G1級及T1組中PIG3蛋白表達值明顯減少，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這提示PIG3蛋白表達降低與膀胱腫瘤復發(fā)或轉移的危險性增加有關，如果在早期和低級別膀胱腫瘤檢測到PIG3蛋白表達值減少，則可能提示該患者有早期轉移趨勢或高復發(fā)風險，應加強綜合治療和定期復診。

說明PIG3蛋白在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中有著特定作用，其表達減少可能是膀胱癌進展及浸潤轉移的指征。我們認為：臨床上對PIG3蛋白的監(jiān)測和研究將有助于膀胱癌的早期診斷及鑒別診斷，并能夠預測腫瘤的發(fā)展趨勢和轉移傾向，有望成為一種新的膀胱腫瘤標記物和新的臨床診斷指標。

［1］Prives C，Hall PA.The p53 pathway［J］.J Pathol，1999，187（1）：112-116.

［2］Porté S，Valencia E，Yakovtseva EA，et al.Three-dimensional structure and enzymatic function of proapoptotic human p53-inducible quinone oxidoreductase PIG3 ［J］.J Biol Chem，2009，284（25）：17194-17205.

［3］Contente A，Dittmer A，Koch MC，et al.A polymorphic microsatellite that mediates induction of PIG3 by p53［J］.Nat Genet，2002，30（3）：315-320.

［4］Flatt PM，Polyak K，Tang LJ，et al.p53-dependent expression of PIG3 during proliferation genotoxic stress and reversible growth arrest［J］.Cancer Lett，2000，156（1）：63-72.

［5］Lee JH，Kang Y，Khare V，et al.The p53-inducible gene 3（PIG3）contributes to early cellular response to DNA damage［J］.Oncogene，2010，29（10）：1431-1450.

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