徐 露

重慶醫(yī)科大學(xué)（重慶 400016）

兩面針總堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用

徐 露

重慶醫(yī)科大學(xué)（重慶 400016）

目的 研究?jī)擅驷樋倝A對(duì)大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用。方法 采用線栓法造成大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈永久性阻塞模型。通過(guò)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死指數(shù)、腦質(zhì)量指數(shù)及腦組織病理學(xué)改變及生化檢測(cè)等指標(biāo)，觀察3種劑量的兩面針總堿對(duì)急性腦缺血的作用，尼莫地平為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果 與模型組相比，兩面針總堿高、中劑量組腦缺血大鼠神經(jīng)癥狀明顯減輕，血清中超氧化物歧化酶含量上升，丙二醛含量降低，腦梗死指數(shù)和腦指數(shù)降低；HE染色顯示各組神經(jīng)元和組織間隙水腫程度明顯減輕；而兩面針總堿低劑量組所有指標(biāo)與模型組差異不明顯。結(jié)論高、中劑量的兩面針總堿有明顯的抗急性腦缺血作用。

兩面針總堿 MCAO 局灶性腦缺血 TTC 梗死指數(shù)

缺血性腦血管病是當(dāng)今死亡率和致殘率較高的疾病之一。尼莫地平是一種腦保護(hù)劑，能有效地阻止Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、抑制平滑肌收縮，達(dá)到解除血管痙攣，增加腦血流量的目的。兩面針系蕓香科花椒屬植物，具有驅(qū)風(fēng)化濕、消腫止痛之功效，主要用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打扭傷腫痛 、神經(jīng)痛、牙痛等。兩面針生物堿為其主要有效成分。本文觀察兩面針總堿對(duì)急性腦缺血的治療作用，為開發(fā)廉價(jià)有效的腦梗死治療藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 兩面針總堿超氧化物歧化酶購(gòu)自安徽致和堂藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20090108，純度＞85%）；尼莫地平購(gòu)自武漢遠(yuǎn)城醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（純度98%，批號(hào)：20090212）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sigma 公司分裝進(jìn)口，批號(hào)：090820001）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20090318）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20090318）

1.2 分組及給藥 SD大鼠 （由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量200～250g，雌雄兼用。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平陽(yáng)性對(duì)照組、兩面針總堿組高、中、低劑量組，每組15只。各組均于術(shù)后3、6、12h灌胃給藥。尼莫地平組按4mg/kg的劑量灌胃給藥，兩面針總堿高、中、低劑量組按照400、200、100mg/kg灌胃給藥。假手術(shù)組及模型組灌胃等量溶劑。

1.3 模型制備 采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型。用4.5%水合氯醛1mL/100g腹腔注射麻醉。頸部正中切口，分離右頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈。在距頸動(dòng)脈分叉5mm處，雙線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈穿線備用，結(jié)扎右頸總動(dòng)脈的近心端。在靠近動(dòng)脈分叉的頸總動(dòng)脈壁上剪一小口，插入一直徑為0.2mm的尼龍魚線（頭端用石蠟薄薄地包裹），經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈起始部，以阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。插入線長(zhǎng)約16mm時(shí)，有明顯阻力感。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈及尼龍線，防止插線脫落。假手術(shù)組除不插入尼龍線外其他手術(shù)步驟相同。

1.4 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分 腦缺血24h后進(jìn)行神經(jīng)缺陷評(píng)分，采用5分制評(píng)分法。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)神經(jīng)缺陷，活動(dòng)正常；1分為左前爪不能充分伸展；2分為大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為大鼠向左側(cè)傾倒；4分為不能自主運(yùn)動(dòng)，精神萎靡。

1.5 腦梗死指數(shù)及腦指數(shù)測(cè)定 大鼠行為學(xué)評(píng)分后稱取體質(zhì)量，斷頭處死，取腦（切除小腦和嗅球），每組選取10個(gè)腦稱質(zhì)量。大腦置于-20℃低溫冰箱中凍存30min，然后平均冠狀切成5片，每片約厚1～2mm，置入2%氯化三苯基四氮唑磷酸緩沖液（pH7.4）中，37℃恒溫水浴中孵育20min，取出后用甲醛固定。正常腦組織染成紅色，白色部分為缺血區(qū)，將其用小刀剔出，稱質(zhì)量。 腦梗死指數(shù)=梗死灶濕質(zhì)量（g）／腦濕質(zhì)量（g）×100%；腦指數(shù)=腦濕質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）×100%。

1.6 血清中SOD、MDA含量檢測(cè) 大鼠斷頭后取血，4℃放置2h，取上層血清，用SOD、MDA試劑盒檢測(cè)血清中SOD和MDA含量。SOD活性采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定，MDA含量采用TBA法測(cè)定。

1.7 病理組織檢查 每組剩余的5個(gè)腦組織置10%甲醛中固定，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片后，HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺陷程度評(píng)分及SOD、MDA含量檢測(cè)結(jié)果見表1。尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組均能降低大鼠神經(jīng)功能缺陷程度評(píng)分 （P＜0.05或0.01），且三者作用相似 （P＞0.05），兩面針總堿低劑量與模型組比較無(wú)差異，與尼莫地平相比有顯著差異（P＜0.01）。與模型組比較，尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組能提高大鼠血清中的SOD含量，降低MDA含量（P＜0.05或 0.01），且 3組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。 而兩面針總堿低劑量組與模型組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），與尼莫地平組差異顯著（P＜0.05或 0.01）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分及SOD和MDA含量比較 （±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分及SOD和MDA含量比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尼莫地平組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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2.2 各組腦梗死指數(shù)及腦指數(shù)比較 見表2。與模型組相比，尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組能明顯降低大鼠腦梗死指數(shù)（P＜0.05或 0.01）和腦指數(shù)（P＜0.05），而兩面針總堿低劑量組與模型組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦梗死指數(shù)及腦指數(shù)比較 （%，±s）

表2 各組大鼠腦梗死指數(shù)及腦指數(shù)比較 （%，±s）

組 別 n 腦梗死指數(shù)假手術(shù)組 10 0腦指數(shù)0.53±0.02*模型組 10 26.75±5.32**0.67±0.11尼莫地平組 10 14.44±3.27** 0.58±0.06*兩面針總堿高劑量組 10 14.36±3.54** 0.55±0.05*兩面針總堿中劑量組 10 15.22±4.83** 0.57±0.06*兩面針總堿低劑量組 10 27.12±5.71△△0.65±0.09△

2.3 病理組織學(xué)檢查 模型組梗死側(cè)腦組織水腫現(xiàn)象明顯，神經(jīng)元腫脹，周圍間隙擴(kuò)大，胞核濃縮，對(duì)側(cè)腦組織未見病理改變。尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組患側(cè)蒼白區(qū)縮小，光鏡下顯示梗死側(cè)腦細(xì)胞水腫程度均明顯減輕，梗死范圍明顯減小，且神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則。提示高、中劑量的兩面針總堿能減輕腦水腫，維持神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的正常，有利于腦損傷的修復(fù)。

圖1 各組大鼠腦組織病理切片（×40）

3 討 論

建立缺血性腦損傷模型，經(jīng)常采用的動(dòng)物模型有全腦和局灶性腦缺血模型。臨床上常見的是局部或區(qū)域性腦缺血，梗死多發(fā)生在大腦中動(dòng)脈。本實(shí)驗(yàn)采用的MCAO模型與臨床常見的腦卒中情況相似。

腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的原因有很多觀點(diǎn)，比較公認(rèn)的有自由基學(xué)說(shuō)、鈣超載、興奮性氨基酸毒性等。正常情況下，腦內(nèi)細(xì)胞可由SOD，過(guò)氧化氫酶等來(lái)清除自由基［1］。缺血缺氧情況下，由于花生四烯酸等活化產(chǎn)生過(guò)多的自由基，由于自由基的鏈鎖反應(yīng)，進(jìn)一步加重膜性結(jié)構(gòu)的破壞和線粒體功能障礙，引起缺血損傷。所以，本實(shí)驗(yàn)中能觀察到模型組腦神經(jīng)元質(zhì)膜破裂，水腫加重［2-5］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：高、中劑量的兩面針總堿能夠明顯降低MCAO腦缺血模型大鼠的神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分、提高血清SOD含量、降低MDA含量、降低腦梗死指數(shù)和腦指數(shù)、改善腦病理形態(tài)，作用效果和尼莫地平相似。其作用機(jī)理可能是通過(guò)清除自由基而起到抑制細(xì)胞膜過(guò)氧化作用，從而對(duì)腦的細(xì)胞穩(wěn)定起到積極的作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，低劑量的兩面針總堿對(duì)腦梗死的治療無(wú)明顯作用，說(shuō)明其存在一定的量效關(guān)系。

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1004-745X（2011）08-1261-02

2011-01-05）