張海紅，曹家松，劉 歡，王永明，黃國(guó)偉

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，天津300070）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteine，HHcy）被確立為心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要獨(dú)立危險(xiǎn)因子，在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有直接的作用[1]。葉酸是Hcy循環(huán)過(guò)程中重要的輔助因子，葉酸水平的升高可促進(jìn)Hcy的再甲基化代謝，從而降低血漿中Hcy水平。葉酸缺乏與大腦的學(xué)習(xí)記憶功能減退存在關(guān)聯(lián)[2]，是認(rèn)知功能障礙的又一危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，葉酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用已成為研究熱點(diǎn)，但葉酸的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過(guò)高蛋氨酸飲食制備大鼠HHcy模型，并予以葉酸干預(yù)，探討Hcy對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及葉酸干預(yù)的效果，觀察葉酸是否能夠通過(guò)降低Hcy水平提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley大鼠，24只，體重250～280 g。購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[許可證號(hào) scxk（津）2009-0001]。

1.1.2 試劑 L-蛋氨酸（分析純）、葉酸（美國(guó)Sigma公司進(jìn)口分裝）購(gòu)自天津市聯(lián)星生物技術(shù)有限公司。大鼠Hcy ELISA試劑盒（美國(guó)RD進(jìn)口分裝）購(gòu)自廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 Morris水迷宮為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所產(chǎn)品。

1.2 研究方法 實(shí)驗(yàn)前，將大鼠自由飼養(yǎng)2周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為正常組、蛋氨酸組、蛋氨酸+葉酸組。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，蛋氨酸組、蛋氨酸+葉酸組給予添加3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)，同時(shí)正常組和蛋氨酸組每天給予0.8 mg/（kg·bw）生理鹽水灌胃，蛋氨酸+葉酸組每天給予0.8 mg/（kg·bw）葉酸灌胃。分別于實(shí)驗(yàn)前（第0周）、干預(yù)后4周、8周、12周、16周內(nèi)眥靜脈取血測(cè)定血漿Hcy濃度。并于16周后采用Morris水迷宮對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.2.1 血漿Hcy測(cè)定 大鼠內(nèi)眥靜脈血1 mL，10%肝素鈉抗凝，3000 r/min離心10 min，取上清液（血漿），使用大鼠Hcy ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟嚴(yán)格遵照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.2.2 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 Morris水迷宮為直徑150 cm、高50 cm圓形水池，水池內(nèi)壁為黑色，池內(nèi)水深25 cm，實(shí)驗(yàn)時(shí)用墨水將水染成黑色，以利于捕捉大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，水溫保持在（25±1）℃，房間內(nèi)光照恒定，池壁上以4個(gè)等距離點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限，在第一象限內(nèi)距離池壁32.5 cm處放有直徑為10 cm、高24 cm的圓形黑色平臺(tái)，平臺(tái)位于水面下1 cm。池壁4個(gè)象限分別貼有不同的標(biāo)記物。池壁向中心15 cm處畫(huà)圓，再向中心15 cm畫(huà)圓，外環(huán)為20%邊緣區(qū)域，中環(huán)為40%邊緣區(qū)域，內(nèi)環(huán)為中心區(qū)域（具體區(qū)域劃分見(jiàn)圖1）。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。

圖1 水迷宮區(qū)域劃分圖Fig 1 Water maze zoning map

1.2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前1 d，讓大鼠熟悉水迷宮環(huán)境，平臺(tái)在第1象限內(nèi)。第2天開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天分別于上午和下午各進(jìn)行4次訓(xùn)練，分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限池壁中心位置的4個(gè)點(diǎn)入水，將大鼠面部背向站臺(tái)沿池壁放入水中，記錄其搜尋平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。如大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引向平臺(tái)，并使其在平臺(tái)上停留30 s，此時(shí)其潛伏期記為120 s，測(cè)試過(guò)程中保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光照、物品等外界條件及空間參照物擺放位置不變，以排除外界條件干擾。

1.2.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天，撤走平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳軌跡，第一次穿越平臺(tái)的時(shí)間，120 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)及在20%邊緣區(qū)域、40%邊緣區(qū)域、中心區(qū)域停留的時(shí)間百分比，并根據(jù)大鼠在水中搜索站臺(tái)的游泳軌跡確定其每次的搜索策略，以此判斷大鼠的記憶能力。搜索方式分為趨向式、隨機(jī)式、邊緣式3種方式，根據(jù)大鼠入水后尋找目標(biāo)區(qū)域的游泳軌跡來(lái)確定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，大鼠血漿Hcy濃度、Morris水迷宮的逃避潛伏期時(shí)間采用重復(fù)測(cè)量方差分析，其它采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血漿Hcy濃度 重復(fù)測(cè)量方差分析表明，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有顯著的時(shí)間和組間效應(yīng)，按不同時(shí)間點(diǎn)分析，隨著給藥周數(shù)的增加，蛋氨酸組大鼠血漿Hcy濃度呈上升趨勢(shì)（P<0.05）。按照不同處理組分析，與正常組比校，蛋氨酸組大鼠血漿Hcy濃度值在第8周、第12周和第16周均高于正常組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與蛋氨酸組比較，蛋氨酸+葉酸組有所下降（P<0.05），具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血漿Hcy濃度比較（n=8,±s，μmol/L）Tab 1 The comparison of plasma Hcy concentrations of rats in each group（n=8,±s，μmol/L）

表1 各組大鼠血漿Hcy濃度比較（n=8,±s，μmol/L）Tab 1 The comparison of plasma Hcy concentrations of rats in each group（n=8,±s，μmol/L）

與正常組比較*P<0.05；與蛋氨酸組比較#P<0.05；與第0周比較△P<0.05；與第 8 周比較★P<0.05

組別正常組蛋氨酸組蛋氨酸+葉酸組第4周9.09±0.809.82±1.208.51±1.11第0周9.06±1.419.10±1.658.28±1.70第8周8.89±1.1411.40±0.48*8.62±0.86#第12周9.25±0.7615.10±0.37*△★8.83±0.81#第16周9.18±0.7817.54±0.11*△★9.08±0.41#

2.2 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期結(jié)果 重復(fù)測(cè)量方差分析表明，Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)具有顯著的時(shí)間和組間效應(yīng)，提示在測(cè)試期間，各組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期時(shí)間隨著訓(xùn)練天數(shù)增加呈顯著性下降趨勢(shì)（P＜0.05），通過(guò)組間比較，在定位航行第1天、第5天，大鼠各組間逃避潛伏期未見(jiàn)明顯差異；定位航行第2天、第3天和第4天，蛋氨酸組潛伏期長(zhǎng)于正常組（P<0.05），蛋氨酸+葉酸組較蛋氨酸組縮短（P<0.05），從整個(gè)定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，各組大鼠雖然在第5天的潛伏期無(wú)明顯差異，但第2天、3天、4天的學(xué)習(xí)過(guò)程中出現(xiàn)顯著性差異，正常組和蛋氨酸+葉酸組的潛伏期縮短較快且比較穩(wěn)定，蛋氨酸組則較弱，說(shuō)明蛋氨酸組大鼠獲得記憶能力的時(shí)間要長(zhǎng)于正常組，蛋氨酸+葉酸組大鼠獲得記憶能力的時(shí)間短于蛋氨酸組。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期時(shí)間（n=8,±s，s）Tab 2 The mean escape latency in place navigation test of rats in each group（n=8,±s，s）

表2 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期時(shí)間（n=8,±s，s）Tab 2 The mean escape latency in place navigation test of rats in each group（n=8,±s，s）

與正常組比較*P<0.05；與蛋氨酸組比較#P<0.05；與第1天比較△P<0.05；與第2天比較★P<0.05

組別正常組蛋氨酸組蛋氨酸+葉酸組第2天77.71±16.86△92.94±15.52*△65.90±16.47#△第3天43.24±9.59△★67.76±16.43*△★41.72±7.44#△★第4天31.60±11.25△★45.74±13.31*△★27.66±7.75#△★第5天14.33±5.85△★17.00±6.17△★14.67±8.31△★第1天93.51±16.23★107.10±10.19★98.22±13.77★

2.3 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常組相比，蛋氨酸組大鼠在第Ⅰ象限內(nèi)停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)、40%邊緣區(qū)域停留時(shí)間減少，第一次穿越目標(biāo)區(qū)時(shí)間、20%邊緣區(qū)域停留時(shí)間、路徑長(zhǎng)度增長(zhǎng)（P<0.05）；與蛋氨酸組相比，蛋氨酸+葉酸組在第Ⅰ象限內(nèi)停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)、40%邊緣區(qū)域停留時(shí)間增多，第一次穿越目標(biāo)區(qū)時(shí)間、20%邊緣區(qū)域停留時(shí)間、路徑長(zhǎng)度減少（P<0.05）。從120 s內(nèi)的游泳軌跡圖（圖2）中可以看出，各組大鼠尋找平臺(tái)的搜索策略和游泳路徑也有所不同，正常組、蛋氨酸+葉酸組大鼠通過(guò)趨向式的搜索方式向著平臺(tái)所在區(qū)域?qū)ふ移脚_(tái)，游泳路徑相一致，蛋氨酸組則通過(guò)隨機(jī)式的搜索方式在各象限尋找平臺(tái)，游泳路徑表現(xiàn)出明顯差異，綜合整個(gè)空間探索實(shí)驗(yàn)，蛋氨酸組大鼠記憶保持能力降低，蛋氨酸+葉酸組大鼠記憶保持能力得到改善。具體結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 The results of spatial probe test of rats in each group

表4 各組大鼠在不同區(qū)域停留的時(shí)間百分比（%）Tab 4 The percentage of time spent on different region of rats in each group（%）

圖2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)軌跡圖Fig 2 The tracing image of spatial probe test of rats in each group

3 討論

葉酸是Hcy代謝過(guò)程中重要的甲基供體，葉酸缺乏時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生HHcy血癥，有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的葉酸攝入可有效的降低阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病率或延緩病情的發(fā)生發(fā)展[3-4]。

Alagidisa等[5]通過(guò)給成年大鼠注射Hcy，第14周進(jìn)行水迷宮測(cè)試時(shí)出現(xiàn)差異。Baydas等[6]通過(guò)促黑素可降低血漿Hcy水平，并改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。通過(guò)給予大鼠高蛋氨酸飼料，成功建立HHcy模型，并予以葉酸灌胃干預(yù)，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)，多方位、多角度，全面跟蹤分析大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況。Morris水迷宮是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在水中尋找隱藏平臺(tái)并通過(guò)分析其尋找平臺(tái)所用時(shí)間和所走路徑判斷其記憶功能好壞的實(shí)驗(yàn)方案，是一種研究空間學(xué)習(xí)記憶的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)[7]。通過(guò)各項(xiàng)結(jié)果顯示，蛋氨酸組大鼠血漿Hcy水平隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)高于正常組（P<0.05），蛋氨酸+葉酸組的血漿Hcy水平低于蛋氨酸組，說(shuō)明通過(guò)葉酸的干預(yù)可以促進(jìn)體內(nèi)Hcy代謝，降低血漿中Hcy的水平。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體內(nèi)Hcy的升高對(duì)大鼠獲取學(xué)習(xí)記憶能力有一定的影響，通過(guò)補(bǔ)充葉酸可以提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明體內(nèi)Hcy的升高對(duì)大鼠保持記憶能力有損傷作用，補(bǔ)充葉酸可以改善大鼠保持記憶的能力。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)行為學(xué)檢測(cè)表明，血漿中Hcy含量升高對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退有一定的影響，提示通過(guò)早期補(bǔ)充葉酸可以降低血漿中的Hcy濃度，并改善學(xué)習(xí)記憶能力。關(guān)于葉酸改善學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制，目前尚處在研究初期階段，筆者之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充葉酸能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，并能促進(jìn)成年動(dòng)物缺氧損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行生長(zhǎng)、修復(fù)[8-10]，但葉酸對(duì)認(rèn)知功能的具體作用機(jī)制還有待從分子水平進(jìn)一步深入探討。

［1］謝榮，李金賢，牛曉珊，等.血漿同型半胱氨酸與腦血管病相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（11）：1056

［2］楊慧敏，林茹珠，廖國(guó)儀，等.葉酸缺乏與學(xué)習(xí)記憶及海馬突觸體膜流動(dòng)性相關(guān)性研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：357

［3］Leblhuber F,Walli J,Artner-Dworzak E,et al.Hyperhomocysteinemia in dementia[J].Neural Transm,2000,107（12）:1469

［4］王魯寧，王青，汪茜，等.老年性癡呆患者血清葉酸和維生素B12的臨床觀察[J].卒中與神經(jīng)疾病,2003,10（4）:230

［5］Algaidi SA,Christie LA,Jenkinson AM,et al.Long-term homocysteine exposure induces alterations in spatial learning,hippocampal signalling and synaptic plasticity[J].Exp Neurol,2006,197（1）:8

［6］Baydas G,Ozer M，Yasar A，et al.Melatonin improves learning and memory performances impaired by hyperhomocysteinemia in rats[J].Brain Res,2005,1046（1/2）:187

［7］Maei HR,Zaslavsky K,Teixeira CM,et al.What is the most sensitive measure of water maze probe test performance[J].Front Integr Neurosci,2009,3:4

［8］Liu H,Huang GW,Zhang XM,et al.Folic acid supplementation stimulatesnotchsignalingandcellproliferationin embryonic neural stem cells[J].J Clin Biochem Nutr,2010,47（2）:174

［9］趙瑩，常紅，黃國(guó)偉，等.葉酸對(duì)局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,15(3)：342

［10］Iskandar BJ,Nelson A,Resnick D,et al.Folate supplementation enhances repair of the adult central nervous system[J].Ann Neurol,2004,56（2）:221