龍成美 王金根 李新長(zhǎng)

MSI和MMP-9檢測(cè)在膀胱上皮細(xì)胞癌的臨床意義

龍成美 王金根 李新長(zhǎng)

目的探討微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)在膀胱上皮細(xì)胞癌(UCC)中的表達(dá)及其與腫瘤臨床分期、病理分級(jí)、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。方法選擇4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)應(yīng)用PCR方法檢測(cè)44例UCC和10例正常膀胱組織的MSI，并采用免疫組化(SP法)檢測(cè)MMP-9的表達(dá)。結(jié)果44例UCC中MSI表達(dá)率為77.3%，強(qiáng)陽性表達(dá)率為45.5%，MMP9陽性表達(dá)率為61.4%，強(qiáng)陽性表達(dá)率為38.6%。MSI和MMP9的強(qiáng)陽性表達(dá)率隨分級(jí)分期增高而增高(P＜0.05)，復(fù)發(fā)組兩者強(qiáng)陽性率高于新發(fā)組(P＜0.05)，UCC中MSI與MMP-9強(qiáng)陽性表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率高于弱陽性表達(dá)組(P＜0.05)，術(shù)后生存率低于弱陽性表達(dá)組(P＜0.05)。兩者同時(shí)表達(dá)強(qiáng)陽性組的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高于單個(gè)強(qiáng)陽性表達(dá)組(P＜0.05)，術(shù)后生存率低于單個(gè)強(qiáng)陽性表達(dá)組 (P＜0.05)。MSI和MMP9在10例正常膀胱組織中均呈陰性表達(dá)。結(jié)論MSI及MMP-9的表達(dá)與UCC的臨床分期、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在膀胱上皮細(xì)胞癌診斷和術(shù)后隨訪中有重要意義。

MSI;MMP-9;膀胱上皮細(xì)胞癌;復(fù)發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移

膀胱上皮細(xì)胞癌(urothelial cell carcinoma，UCC)是常見泌尿系惡性腫瘤之一。早期研究認(rèn)為膀胱癌的發(fā)生與微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)有關(guān)，近年來研究表明蛋白水解酶9(metalloproteinase-9，MMP-9)與 UCC的浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)［1-4］。本文通過研究UCC組織中 MSI和MMP-9的表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)、及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，找尋膀胱腫瘤早期診斷和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的簡(jiǎn)單有效方法，并為臨床治療隨訪提供依據(jù)。

資料和方法

1.一般資料:本組44例UCC腫瘤組織、外周血標(biāo)本均來自江西省人民醫(yī)院2008年1月至2010年12月住院患者，經(jīng)膀胱鏡活檢或術(shù)后病理證實(shí)為UCC，患者年齡從38～78歲，平均62歲，其中男性40例，女性4例。臨床分期按TNM分期，病理分級(jí)按WHO標(biāo)準(zhǔn)確定，GⅠ8例，GⅡ12例，GⅢ24例，Ta-T1期24例，T2-T4期20例，新發(fā)35例，復(fù)發(fā)9例。－80℃深低溫冰霜保存腫瘤標(biāo)本;同時(shí)留取患者外周靜脈血4 ml加EDTA抗凝液，編號(hào)保存于深低溫冰霜。正常膀胱組織10例，分別來自良性前列腺增生癥、膀胱憩室、尿石癥、尿道狹窄。本組44例均獲得長(zhǎng)期臨床隨訪。

2.主要試劑和方法

(1)PCR方法檢測(cè)MSI:標(biāo)本經(jīng)蛋白酶K消化后，采用經(jīng)典的酚-氯仿-異戊醇抽提法稍加改進(jìn)提取DNA，PCR擴(kuò)增，電泳，電泳結(jié)束后在紫外透射下觀察，選取中國(guó)人UCC最易發(fā)生微衛(wèi)星改變的4個(gè)位點(diǎn):D9S54、D9S162、D9S747、IFN-A1，引物序列查自http://www.gdb.com，由上海長(zhǎng)城生物公司合成。以DL-2000Marker做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，結(jié)果予照相并進(jìn)行分析。

(2)免疫組化SP法檢測(cè)MMP-9:每例石蠟標(biāo)本均以4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓修復(fù)抗原，嚴(yán)格按試劑盒說明書染色，封片后鏡檢。MMP-9以已知陽性乳腺癌組織作為陽性對(duì)照，以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。鼠抗人MMP-9單克隆抗體和SP超敏試劑盒購自福州邁新生物有限公司。

3.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):MSI:以外周血淋巴細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為正常對(duì)照，與膀胱腫瘤標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物在相鄰的條帶上于同一條件下進(jìn)行電泳，若腫瘤組織的條帶與正常相比出現(xiàn)額外條帶或等位基因電泳條帶的位置改變即判定為微衛(wèi)星不穩(wěn)定，以出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上位點(diǎn)MSI記為MSI強(qiáng)陽性，0～1個(gè)位點(diǎn)MSI記為MSI弱陽性。MMP-9:隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡(×400)視野下的陽性細(xì)胞。MMP-9陽性為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在淺黃色至棕黃色顆粒，以陽性細(xì)胞百分率＜10%為陰性(-)，10%～50%為弱陽性(+)，＞50%為強(qiáng)陽性(++)。

4.實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)臨床及病理特征分組，低分級(jí)組(Ⅰ、Ⅱ級(jí)，n=20)和高分級(jí)組(Ⅲ級(jí)，n=24);低分期組(Ta-T1期，n=24)和高分期組(T2-T4期，n=20)，新發(fā)組(n=35)和復(fù)發(fā)組(n=9)，MSI強(qiáng)陽性表達(dá)組(n=20)和弱陽性表達(dá)組(n=24)，MMP-9強(qiáng)陽性表達(dá)組(n=17)和弱陽性表達(dá)組(n=27)。比較各組間MSI和MMP-9的強(qiáng)陽性表達(dá)率是否存在差異，以此分析二者的表達(dá)與UCC臨床病理特征及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0軟件包行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用卡方檢驗(yàn)或Fisher’s精確概率檢驗(yàn)法分析MSI及MMP-9在不同分組中陽性表達(dá)率的差異。以Log-rank法比較不同分組中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

結(jié) 果

1.MSI和 MMP-9在組織中的表達(dá):MSI和MMP-9在正常對(duì)照膀胱組織中均呈陰性表達(dá)，44例UCC中 MSI表達(dá)率為77.3%，強(qiáng)陽性表達(dá)率為45.5%，MMP9陽性表達(dá)率為61.4%，強(qiáng)陽性表達(dá)率為 38.6%。

2.MSI和MMP-9表達(dá)與臨床病理分級(jí)的關(guān)系:MSI高分期分級(jí)組強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于低分期分級(jí)組(P＜0.05);復(fù)發(fā)組顯著高于新發(fā)組(P＜0.05)。MMP-9高分期組、高分級(jí)組、復(fù)發(fā)組強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于低分期組、低分級(jí)組、新發(fā)組(P＜0.05)。

3.MSI和MMP-9強(qiáng)陽性與預(yù)后的關(guān)系:術(shù)后隨訪顯示MSI、MMP-9強(qiáng)陽性表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高于弱陽性表達(dá)組(P＜0.05)，而術(shù)后生存率則低于弱陽性表達(dá)組(P＜0.05)。兩者同時(shí)表達(dá)強(qiáng)陽性組的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高于單個(gè)強(qiáng)陽性表達(dá)組(P＜0.05)，術(shù)后生存率低于單個(gè)強(qiáng)陽性表達(dá)組(P ＜0.05)。

討 論

1.MSI在UCC組織中的表達(dá)及意義:MSI在膀胱腫瘤的表達(dá)及其在作為膀胱腫瘤早期診斷標(biāo)記物的意義，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得初步成果，研究集中選擇合適的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行非侵入性診斷膀胱腫瘤，有的已開發(fā)試用于臨床。Vaish等［1］在評(píng)估膀胱癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，在淺表膀胱腫瘤組83%存在MSI且腫瘤分級(jí)高，MSI陽性者27%有肌層浸潤(rùn)。Amira等［2］研究膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的非侵襲性分子檢測(cè)結(jié)果表明，初發(fā)腫瘤MSI陽性率為94%(44/47)，復(fù)發(fā)腫瘤 92%(9/12)，并觀察到75%(9/12)MSI檢測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)比膀胱鏡檢查早1～9個(gè)月。Molina等［3］選取10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)UCC發(fā)現(xiàn)72.7%存在MSI，且與腫瘤分級(jí)分期相關(guān)，MSI陽性患者易出現(xiàn)一次或多次腫瘤復(fù)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對(duì)照膀胱組織中MSI表達(dá)陰性，而在UCC組織中則多呈強(qiáng)陽性表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。MSI與UCC臨床病理分期分級(jí)相關(guān)，強(qiáng)陽性表達(dá)率隨著臨床分期分級(jí)的增高而增加;復(fù)發(fā)組強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于初發(fā)組;且有5例比膀胱鏡提前檢出膀胱腫瘤，提示MSI可作為于腫瘤早期診斷和監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的方法之一，并且MSI檢測(cè)可為臨床治療提供思路如早期選擇膀胱全切或放療等。

2.MMP-9在UCC組織中的表達(dá)及意義:研究發(fā)現(xiàn)，MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［4］。MMP-9是MMPs家族中的重要成員，是水解Ⅳ型膠原的關(guān)鍵酶，又稱為明膠酶B。目前認(rèn)為MMP-9參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制是MMP-9能降解Ⅳ型膠原，為腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散性生長(zhǎng)去除機(jī)械屏障，并介導(dǎo)新生血管的形成;其次，MMP-9可以通過影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞的粘附性而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MMP-9的表達(dá)水平與UCC臨床分期、病理分級(jí)密切相關(guān)，強(qiáng)陽性表達(dá)率隨著臨床分期、病理分級(jí)的增高而增加;復(fù)發(fā)組強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于新發(fā)組;結(jié)合臨床隨訪資料進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達(dá)水平與UCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)UCC惡性程度及預(yù)后的重要指標(biāo)。

3.MSI和MMP-9在UCC組織中表達(dá)的臨床意義:膀胱鏡檢查是診斷和隨訪UCC的金標(biāo)準(zhǔn)。但因膀胱鏡檢查的有創(chuàng)性，患者多不能耐受而失訪，許多研究者一直致力于其它敏感性和特異性高的檢測(cè)方法以用于術(shù)后診斷和隨訪［5］。本實(shí)驗(yàn)研究MSI和MMP-9在UCC組織中的表達(dá)，結(jié)果表明兩者在UCC組織中的表達(dá)率高，聯(lián)合檢測(cè)比單個(gè)檢測(cè)更有助于判斷預(yù)后，在UCC的診斷隨訪檢查中有較大的應(yīng)用前景。

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2 Amira N，Mourah S，Rozet F，et al.Non-invasive molecular detection of bladder cancer recurrence［J］.Cancer，2002，101(3):293-297.

3 Molina Burgos R，Millán Salvador JM，Oltra Soler JS，et al.Microsatellite analysis in exfoliated cells from urinary sediment.Its utility for the detection of bladder cancer.Comparison with urinary cytology［J］.Actas Urol Esp，2003，27(8):618-628.

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Expressions of MSI and MMP-9 in Urothelial Cell Carcinoma

LONG Cheng-mei，WANG Jingen，LI Xing-chang(Department of Organ Transplantation，Jiangxi Province People’s Hospita，Nanchang 330006，China)

ObjectiveTo explore the expressions of microsatellite instability(MSI)and metalloproteinase-9(MMP-9)in urothelial cell carcinoma(UCC)and to determine their relationship with clinic stages，pathological characters，recurrence metastasis and survival.Methods4 microsatellite markers were selected to detect the expressions of MSI with PCR in 44 tissues of UCC and 10 tissues of normal mucosa of bladder.Immunohistochemistry was used to detect the expressions of MMP-9.ResultsMSI was found in 34 of 44 UCC patients(77.3%)，MMP-9 was in 27 of 44 UCC patients(61.4%)，and the strongly positivity rate of MSI and MMP-9 in UCC were 45.5%and 38.6%;The strongly positive rate of MSI and MMP-9 in UCC closely correlated with higher clinical stages and pathological characters(P ＜0.05)，postoperative recurrence was higher than original group(P ＜0.05).The postoperative follow-up showed that the group of MSI and MMP-9 strongly positive had a higher risk of recurrence/metastasis and a lower survival rate than the group of weakly positive(P ＜0.05)，the rate of both MSI and MMP-9 strongly positive was higher than the rate of MSI or MMP-9 separately strongly positive(P ＜0.05);The group of both MSI and MMP-9 strongly positive had a lower survival rate than the group of MSI or MMP-9 separately strongly positive(P ＜0.05).While in normal controls all were negative.ConclusionsThe expression of MSI and MMP-9 closely correlated with the clinical stage and pathological grade of UCC，and affected the risk of recurrence/metastasis.It was suggested that they may play some role in the prognosis and follow-up of patients with UCC.

MSI;MMP-9;Urothelial cell carcinoma;Recurrence/metastasis

330006 江西省人民醫(yī)院器官移植科