張艷平 丁矢 向秋玲 李雪蘭 歐勇 袁莉

動脈粥樣硬化發(fā)生的諸多影響因素中，血脂水平代謝異常是造成動脈粥樣硬化死亡率及罹患率增加的主要因素[1]。最近發(fā)現(xiàn)，人類前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)是2003年發(fā)現(xiàn)的涉及常染色體顯性高膽固醇血癥的第三個基因[2]，編碼前蛋白轉(zhuǎn)化酶NARC-1(neural apoptosis-regulated convertase 1)。pcsk9基因連鎖顯示其與常染色體顯性遺傳的高膽固醇血癥有關(guān)。目前Narc-1/pcsk9作為一個新的治療靶點已成為高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化研究的熱點，對進一步深入探索新的防治途徑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料30只健康純種雄性新西蘭大白兔由湖南省實驗動物中心提供;NARC-1免疫印跡試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司;蘇木素復染液以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。DMR+Q550型圖像分析儀系德國Leic公司產(chǎn)。

1.2 動物模型建立與實驗分組選取5月齡健康純種雄性新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量(2.3±0.8)kg。采用單籠喂養(yǎng)，飲水不限。通過適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為兩組:對照組(A組)15只，給予飼喂普通顆粒飼料;高膽固醇組(B組)15只，給予飼喂常規(guī)顆粒飼料中添加5%膽固醇、8%豬油、7%蛋黃粉。兩組分別喂養(yǎng)12周。

1.3 病理組織學檢測喂養(yǎng)12周末，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣15～20 ml處死動物后，剖開胸腔及腹腔，將心臟至左右髂動脈分叉處的主動脈離斷并縱行剖開，生理鹽水沖洗血管壁內(nèi)外殘血，4%多聚甲醛固定，進行蘇丹Ⅲ染色，取遠端1.5 crn處組織放入液氮中保存，用于免疫印跡。免疫印跡分析按照試劑盒的說明進行。應用圖像分析系統(tǒng)測定斑塊面積。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組內(nèi)及組間對照采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高膽固醇對主動脈內(nèi)膜的影響肉眼下正常對照組管腔面光滑，無脂質(zhì)沉積;高膽固醇組出現(xiàn)了明顯的動脈粥樣硬化病變，脈管壁大量干酪樣脂質(zhì)斑塊物質(zhì)凸向管腔。經(jīng)圖像分析儀檢測，高膽固醇組主動脈內(nèi)膜面粥樣硬化病變面積為(27.41±2.12)%，與對照組(0.51±0.20)%相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 形態(tài)學改變光鏡下正常對照組內(nèi)皮細胞完整，管腔內(nèi)皮光滑，血管壁層次清晰，無明顯增生。高膽固醇喂養(yǎng)組動物血管壁結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮細胞腫脹、變性，部分缺失;內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)含大量泡沫細胞，內(nèi)彈力膜斷裂，可見斑塊形成;中膜不規(guī)則增生，平滑肌細胞排列紊亂，胞體變大，可見鈣化斑，斑塊中大量炎性細胞浸潤。

2.3 主動脈NARC-1表達的比較免疫組化顯示正常對照組主動脈組織中僅見少量棕色染色顆粒，高膽固醇組主動脈組織中NARC-1呈強陽性表達，尤以斑塊中的表達最為明顯。高膽固醇喂養(yǎng)組動物主動脈中NARC-1的表達(7532±323)pixel intensity/mm2/μg較正常對照組(1532±452)pixel intensity/mm2/μg顯著升高，經(jīng)t檢驗，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

血脂代謝水平紊亂是造成動脈粥樣硬化性心臟病的最主要的危險因素，而血液中脂質(zhì)代謝異常為多個基因之間或多個基因與環(huán)境因素之間相互作用的結(jié)果。近來研究發(fā)現(xiàn)，Narc-1/pcsk9主要作用是通過負調(diào)節(jié)細胞表面的LDLR表達來減少LDL肝攝取，從而使血漿LDL清除減少和LDL-膽固醇(LDLC)升高[3]。PCSK9在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中以可溶性酶原的前體形式合成，經(jīng)過分子內(nèi)自我催化加工生成成熟蛋白后分泌到血漿中發(fā)揮其自身作用[4]。大量的臨床流行病學資料一致證實，高LDL膽固醇血癥是一個已被確認的獨立危險因素，表明血清低密度脂蛋白膽固醇升高可誘發(fā)和促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[5]。本實驗采用高膽固醇顆粒食物喂養(yǎng)動物12周后，肉眼下高膽固醇組出現(xiàn)了明顯的動脈粥樣硬化病變，脈管壁大量干酪樣脂質(zhì)斑塊物質(zhì)凸向管腔，經(jīng)檢測主動脈內(nèi)膜面粥樣硬化病變面積(27.41%±2.12)%較正常對照組(0.51%±0.20%)相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果證實高脂食物確實是誘發(fā)動脈硬化發(fā)生的因素之一。

有研究發(fā)現(xiàn)PCSK9突變引起常染色體顯性高膽固醇血癥，PCSK9突變形式多樣，有PCSK9基因錯義突變的人群，其血漿LDLC水平明顯降低，表明抑制PCSK9的活性有助于增加LDLR數(shù)量[6]。同樣的研究結(jié)果也出現(xiàn)在PCSK9基因敲除小鼠實驗中，PCSK9基因敲除小鼠的肝細胞LDLR受體數(shù)量明顯增多，并加速了血漿LDL的清除，從而降低了LDLC水平[7]。然而無論是野生型還是突變體，PCSK9的過表達都是通過翻譯后機制來降低LDL-R的水平。本實驗通過建立動脈硬化動物模型，檢測出動脈硬化組動物主動脈內(nèi)膜NARC-1蛋白的表達(7532±323)pixel intensity/mm2/μg較正常對照組(1532±452)pixel intensity/mm2/μg顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。證實NARC-1與動脈粥樣硬化的發(fā)生是相關(guān)的。

目前，有國外文獻認為PCSK9從兩方面影響血漿中LDLC的水平，一是維持合適的LDLR水平;二是調(diào)節(jié)apoB的分泌量。Narc-1/pcsk9可通過調(diào)節(jié)細胞表面低密度脂蛋白受體(LDLR)，PCSK9和LDLR也共同受到膽固醇的調(diào)節(jié)，PCSK9是通過調(diào)節(jié)LDLR功能另一新的旁路機制，還是經(jīng)典的通過SREBP介導的膽固醇抑制轉(zhuǎn)錄效應，還有待我們深入研究探討，也能為動脈粥樣硬化的研究提供更有效地藥物防治方法和途徑。

[1]Douglas MR，Lewthwaite AJ，Nieholl DJ.Genetics of Parkinson's disease and parkinsonism.Expert Rev Neurother，2007，7(6):657-666.

[2]coon KD，Myers AJ，Craig DW，et al.A high-density whole-genome association study reveals that APOE is the major susceptibility gene for sporadic late-onset Alzheimer's disease.J Clin Psychiatry，2007，68(4):613-618.

[3]藺潔，王綠婭，夏軍輝，等.家族性高膽固醇血癥患者新的致病基因——PCSK9基因突變分析.中國動脈粥樣硬化雜志，2007，15(7):612-615.

[4]Fasano T，Sun XM，Patel DD，et al.Degradation of LDLR protein mediated by'gain of function'PCSK9 mutants in normal and ARH cells.Atherosclerosis，2009，203(1):166-171.

[5]Bedi M.Niesen D.Inhibition of squalene synthase upregulates PCSK9 expression in rat liver.Arch Biochem Biophys，2008，470(2):116-119.

[6]Cameron J.Holla OL，Lacrdahl JK，d 02.Mutation s462P in then-PCSK9 gene reduces secretion of mutant PCSK9 without affecting the autoeatalutlccleavage.Atheroaclerbsis，2009，203(2):161-165.

[7]Steinberg D，Witztum JL.Inhibiton of PCSK9:A powerful weapon for achieving ideal LDL eholesterol levels.Proe Nail Aead Sei USA，2010，106(24):9546-9547.