廖志鐘 歐國燈 翁雪萍

(1.廣東羅浮山國藥股份有限公司 廣東惠州 516133； 2.廣東省藥品檢驗(yàn)所 廣州 510180；3.廣東省惠州市藥品檢驗(yàn)所 廣東惠州 516003)

消炎利膽片由穿心蓮、苦木、溪黃草三味中藥組成,其主要功能為清熱、祛濕,利膽。用于肝膽濕熱引起的口苦、脅痛;急性膽囊炎、膽管炎。穿心蓮為方中主藥,所含多種內(nèi)酯,2000年版中國藥典2003年增補(bǔ)本中收載了本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),標(biāo)準(zhǔn)中只建立了脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定方法。經(jīng)研究,穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯兩成份在一定條件下存在互變性,單純選擇脫水穿心蓮內(nèi)酯為含量測定指標(biāo)不科學(xué)。本論文同時(shí)選擇穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯為控制該產(chǎn)品質(zhì)量的定量指標(biāo),采用高效液相色譜法建立其含量測定方法,該法簡便、靈敏、準(zhǔn)確,科學(xué)可行。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜系統(tǒng)(LC-10ATvp泵,SPD-M20A型二極管陣列檢測器);穿心蓮內(nèi)酯(0797-200106)和脫水穿心蓮內(nèi)酯(0854-200204)對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所;消炎利膽片10批均由廣東羅浮山藥業(yè)有限公司提供;甲醇為色譜純試劑,水為超純水,其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Dikma Technologies Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5um)色譜柱;流動(dòng)相:甲醇-水(55∶45);檢測波長:穿心蓮內(nèi)酯為225nm、脫水穿心蓮內(nèi)酯為254nm;流速:1.0mL／min;進(jìn)樣量:10μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量,加50%甲醇制成每1mL含穿心蓮內(nèi)酯0.08mg、脫水穿心蓮內(nèi)酯0.20mg的溶液,搖勻,即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片,除去包衣,精密稱定,研細(xì),取約0.3g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50mL,密塞,稱定重量,超聲處理30min,放冷,再次稱定重量,用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液5mL,置中性氧化鋁柱(200～300目,4g,內(nèi)徑1.5cm)上,用70%乙醇30mL洗脫,收集洗脫液,蒸至近干,加甲醇使溶解,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取穿心蓮內(nèi)酯35.38mg和脫水穿心蓮內(nèi)酯102.16mg,分別制成每1mL分別含穿心蓮內(nèi)酯14.152、70.76、141.52、212.28、283.04μg及脫水穿心蓮內(nèi)酯40.864、204.32、408.64、612.96、817.28μg的溶液,分別吸取上述溶液各10μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,測定峰面積積分值,分別以進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為:Y=2147051.8X-16559(R=0.9996,n=6),穿心蓮內(nèi)酯在0.14152～2.8304μg范圍內(nèi)濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系;脫水穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為:Y=1566673.6X-34074(R=0.9996,n=6),脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.4 0 8 6 4～8.1 7 2 8 μ g范圍內(nèi)濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系;穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為:Y=1703326.2.8X-1388.9(R=0.9999,n=6),兩成份總量在0.55016～13.754μg范圍內(nèi)濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液l0μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,測定峰面積值,穿心蓮內(nèi)酯RSD=0.056%,脫水穿心蓮內(nèi)酯RSD=0.088%,穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量總和RSD=0.14%。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

(1)重復(fù)性試驗(yàn)。按擬定的含量測定方法,由同一分析員對(duì)同一樣品(批號(hào):0504051)連續(xù)測定6次,并計(jì)算含量,結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯RSD(n=6)為2.0%;脫水穿心蓮內(nèi)酯RSD(n=6)為2.3%,穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量總和RSD(n=6)為1.25%。

(2)中間精密度試驗(yàn)。取同一批供試品(批號(hào):L06G021),分別由A、B、C三人在不同的時(shí)間,用同一臺(tái)儀器上,按含量測定方法依法測定。結(jié)果中間精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液,分別于0、2、4、8、10、12h后進(jìn)樣10μL,測定穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積,結(jié)果表明,供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 空白試驗(yàn)

按照本品處方,取除穿心蓮?fù)獾钠溆嗨幉?按制備工藝要求,制成不含穿心蓮藥材的陰性樣品,制成不含穿心蓮藥材的陰性對(duì)照溶液并測定。結(jié)果表明陰性對(duì)照在與穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上無干擾。

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批供試品(批號(hào):0 5 0 4 0 5 1;含量:穿心蓮內(nèi)酯9.7296mg/g,脫水穿心蓮內(nèi)酯31.2639mg/g)9份,分成3組,每組各3份,每份約0.15g,分別精密加入穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量,按供試品溶液制備方法,自“密塞,稱定重量”起操作,測定。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯回收率為99.3%,RSD為1.89%;脫水穿心蓮內(nèi)酯回收率99.4%,RSD為2.99%,穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯總回收率為99.4%,RSD為2.19%。

3 討論

(1)本實(shí)驗(yàn)經(jīng)對(duì)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外全波長描述,穿心蓮內(nèi)酯于225nm有最大吸收,脫水穿心蓮內(nèi)酯于251nm有最大吸收,參考中國藥典[1],本試驗(yàn)穿心蓮內(nèi)酯檢測波長選擇225nm,脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長選擇254nm。

(2)經(jīng)查找有關(guān)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測定文獻(xiàn)[2～7],經(jīng)試驗(yàn)以甲醇-水(55∶45)為流動(dòng)相時(shí),穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰分離度和拖尾因子等較理想,因此,本法選擇甲醇-水(55∶45)為流動(dòng)相。

(3)供試品溶液的制備比較了甲醇、70%乙醇、95%乙醇作為提取溶劑超聲提取30min,結(jié)果顯示,采用乙醇提取含量較甲醇提取含量高,以70%乙醇提取含量最高,故確定以70%乙醇為提取溶劑,超聲提取30min。

(4)在純化處理時(shí),對(duì)比了過中性氧化鋁柱和不過中性氧化鋁柱,經(jīng)考察,不過中性氧化鋁柱時(shí)雜質(zhì)干擾大,過中性氧化鋁柱后雜質(zhì)無干擾,峰型等符合要求,因而采用過中性氧化鋁柱除雜質(zhì)純化的方法。

(5)在過中性氧化鋁柱時(shí),經(jīng)用甲醇、75%乙醇及95%乙醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫,結(jié)果采用70%乙醇洗脫較完全,故選用70%乙醇為洗脫劑。

(6)在洗脫劑用量選擇方面,經(jīng)考察用70%乙醇20、30、40mL洗脫,結(jié)果顯示,用30mL洗脫已完全,因此洗脫劑用量選擇30mL溶劑即可。

(7)本文建立了高效液相色譜法測定消炎利膽片穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量,方法的重現(xiàn)性好,分離度好,專屬性強(qiáng),選擇指標(biāo)成份科學(xué)合理,可用于消炎利膽片的質(zhì)量控制,具有可行性。

[1]中國藥典2005年版一部.

[2]曾寶,謝友良.穿心蓮軟膠囊中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2005:10.

[3]牛其云,李傳河.高效液相色譜法測定穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].中國藥事,2005:9.

[4]莫建霞,張曉君.不同生長期穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的動(dòng)態(tài)研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2003:2.

[5]黃紅雯,余少婷.高效液相色譜法測定穿心蓮片中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].中國藥事,2003:8.

[6]楊建國,吳韶銘.HPLC法測定痢瀉靈片中穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].中成藥,1996:6.

[7]楊蕾.消炎利膽片中穿心蓮和苦木的同板薄層色譜鑒別徐韌柳[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2005:6.