劉洪鳳 任巖海 韓智學(xué) 崔榮軍 王桂云 申梅淑 宋高臣

(牡丹江醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

目前對胰島素抵抗(IR)發(fā)病機制的研究熱點已集中在分子及基因水平。胰島素受體后缺陷在IR的環(huán)節(jié)中意義尤為突出。其中外周組織對葡萄糖攝取、利用的減少是受體后IR的主要原因。即葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)，是介導(dǎo)葡萄糖攝取的因子，其介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運是外周組織葡萄糖利用的限速步驟，這一過程發(fā)生障礙則引起IR、高血糖癥和肥胖。GLUT4在葡萄糖動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用，是一種十分重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體，與 IR和2型糖尿病(T2DM)密切相關(guān)〔1〕。黃芪多糖(APS)是中藥黃芪的主要活性成分，有明顯降血糖作用〔2～4〕，但是從分子生物學(xué)角度研究其降糖機制還未見有報道。本實驗通過觀察APS對T2DM模型大鼠的GLUT4 mRNA表達的影響，探討其降低T2DM大鼠IR的分子生物學(xué)機制，為其治療T2DM提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級Wistar大鼠84只，體重(250±50)g，雌雄各半，購自佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心。APS(惠州市東方植物保健科技有限公司提供);鏈脲佐菌素(Sigma公司產(chǎn)品);RT-PCR試劑(TOYOBO公司產(chǎn)品);PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 大鼠模型的制備及分組 Wistar大鼠84只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機選取70只大鼠，給以高脂高糖飲食喂養(yǎng);另取正常大鼠14只，給以基礎(chǔ)飼料飲食。8 w后，共篩選出IR模型大鼠62只，尾靜脈注射STZ注射液25 mg/kg;正常組大鼠，注射相同體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。2 d后，以11.1 mmol/L≤FBG＜33.3 mmol/L且伴有糖耐量減退和IR者為早期T2DM胰島素抵抗大鼠模型成功。將造模成功的56只大鼠隨機分為4 組:模型對照組及 APS 800、400、200 mg·kg－1·d－1治療組，腹腔灌胃12 w后，空腹取材后處死大鼠。

1.3 脂肪組織GLUT4 mRNA水平檢測 Trizol法提取大鼠腎周白色脂肪組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳RNA顯示18 S、28 S兩條帶，紫外分光光度計測A值，計算RNA樣品純度，A260:A280＞1.8表明純度高。mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 4 min 1個循環(huán)，94℃變性 45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，35 個循環(huán)后 72℃延伸10 min。以β-actin作為內(nèi)參照。GLUT4(379 bp)上游引物序列:5'-AGCCAGCCTACGCCACCATA-3'，下游引物序列:5'-GGACCCATAGCATCCGCAAC-3';β-actin(225 bp)上游引物序列:5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3'，下游引物序列:5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用UVPDGS-8000型凝膠成像系統(tǒng)成像，并用密度掃描儀分析PCR產(chǎn)物條帶。GLUT4 mRNA表達水平以相對光密度表達量，即GLUT4/β-actin比率計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包處理，定量資料數(shù)據(jù)以±s表示，對組間均數(shù)比較進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

擴增后得到GLUT4(379 bp)和β-actin(225 bp)兩個片段。圖像分析結(jié)果顯示，與正常對照組相比(0.65±0.07)，模型組大鼠GLUT4 mRNA表達明顯降低(0.38±0.08，P＜0.01);與模型對照組比較，APS高、中劑量治療組GLUT4 mRNA表達明顯增高(0.59±0.06，0.63±0.05，P ＜0.01)，低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義(0.41±0.06，P＞0.05)。

3 討論

在T2DM中IR的發(fā)病機制，最主要的因素是骨骼肌和脂肪組織存在IR，IR是T2DM的病理生理過程，IR表現(xiàn)為肌肉、脂肪對葡萄糖攝取減少和抑制肝葡萄糖輸出的作用減弱。許多研究表明，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙可以直接引起IR，而胰島素刺激是通過葡萄糖轉(zhuǎn)運子使葡萄糖進入細(xì)胞內(nèi)，維持機體糖和脂代謝平衡的〔5，6〕。本實驗結(jié)果顯示:①與正常對照組比較，模型組大鼠脂肪組織GLUT4 mRNA表達顯著降低，提示GLUT4基因可能與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān);②與模型組比較，APS高、中劑量治療組脂肪組織GLUT4 mRNA表達顯著升高，提示APS降低血糖、降低IR作用，可能與上調(diào)GLUT4 mRNA表達有關(guān)。因此，GLUT4基因有可能成為治療IR新的藥物作用靶點，但具體作用機制有待進一步研究。

1 XU PY.Dissecting multiple steps of GLUT4 trafficking and identifying the sites of insulin action〔J〕.Cell Metabolism，2007;20(5):47-57.

2 陳 蔚，俞茂華，葉紅英，等.黃芪多糖保護糖尿病心肌的初步研究〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2007;34(4):541-4.

3 蔡 莉，朱 江.黃芪多糖研究現(xiàn)狀與進展〔J〕.中國腫瘤臨床，2007;34(15):896-900.

4 陳 蔚，李益明，俞茂華，等.黃芪多糖對糖尿病鼠T細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007;17(1):28-31.

5 Watson RT，Khan AH，F(xiàn)urukawa M，et al.Entry of newly synthesized GLUT4 into the insulin-responsive storage compartment is GGA dependen〔tJ〕.EMBO J，2004;23(10):2059-70.

6 Khan AH，Capilla E，Hou JC，et al.Entry of newly synthesized GLUT4 into the insulin-responsive storage compartment is dependent upon both the amino terminus and the large cytoplasmic loop〔J〕.J Biol Chem，2004;279(36):37505-11.