葉艷芬 譚國珍 曾凡欽

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells，MSC)具有高度自我更新和多向分化的潛能，并具有支持造血和免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用［1］。大量的體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗［2，3］證明它具有誘導(dǎo)免疫耐受和免疫抑制的特性。MSC移植在SLE治療中具有較廣闊的應(yīng)用前景。了解SLE患者自身MSC是否異常是判斷選擇自體或異體MSC移植治療SLE的重要依據(jù)。SLE患者MSC的體外擴增及其生物學(xué)特性是協(xié)助我們評價SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面。

1 資料與方法

1.1 一般資料 9例SLE患者均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，SLE疾病活動評分(SLEDAI)判斷疾病的活動程度。9例患者的資料見表1。另選5例性別、年齡匹配的健康者作為對照組。

表1 SLE患者臨床資料及BM-MSC體外擴增的基本情況

1.2 骨髓MSC分離培養(yǎng) 采用羥基淀粉沉淀聯(lián)合Ficoll密度梯度離心法和貼壁篩選法分離培養(yǎng)MSC。具體方法無菌操作下抽取骨髓液10 ml，以5×105U/ml肝素鈉抗凝，先用羥基淀粉按1∶4體積加入，靜置20 min，通過自然沉降去除下沉的大量紅細(xì)胞，剩余的含大量紅細(xì)胞的下層液體，再用淋巴細(xì)胞分離Ficoll-Hypaque常規(guī)分離單個核細(xì)胞。將上述兩步分離所得的骨髓單個核細(xì)胞充分混勻，懸浮于體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM-LG培養(yǎng)液中，按約1×106/ml密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)顯微鏡下觀察細(xì)胞已達90%融合時，則可傳代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，美國)消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞并懸浮于完全培養(yǎng)液中，按104/cm2的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天更換1次培養(yǎng)液，約1周待細(xì)胞生長密度達90%左右時，進行再次傳代。

1.3 MTT法檢測MSC的生長情況 MTT比色法檢測SLE患者第2代MSC的生長情況，作傳代細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線分析。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MSC表面分子的表達 細(xì)胞培養(yǎng)擴增到第三代時，分別取100 ul細(xì)胞懸液與鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗體室溫反應(yīng)30 min。流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 MSC的傳代情況及形態(tài) 本實驗進行了9例SLE患者和5例健康對照者MSC體外培養(yǎng)。5例健康對照者MSC均能成功體外擴增。9例患者中，5例MSC能傳代擴增，傳代率為55.6%。其中女性4例，男性1例，年齡16～26歲，平均年齡21.8歲;病程3～24月，平均病程9.8月;DAI評分為15～21，平均評分為18.6。5例SLE患者均合并有腎損害，其中1例合并有血液系統(tǒng)損害。MSC體外擴增不成功的4例SLE患者，均為女性，年齡26～45歲，平均年齡38.2歲;病程6～60月，平均病程37.5月;DAI評分為13-22，平均評分為18.5。4例SLE患者均合并有腎損害，其中2例合并有嚴(yán)重血液系統(tǒng)損害。每例患者的臨床資料及MSC體外培養(yǎng)基本情況見表1。

2.1.1 體外擴增成功者 5例MSC體外擴增成功的SLE患者，MSC生長情況與健康對照組相比較：原代培養(yǎng)時，細(xì)胞形態(tài)上與健康對照組相似，但紡錘形、梭形細(xì)胞的出現(xiàn)稍晚，一般于2～4 d，健康對照組的一般出現(xiàn)于1～2 d內(nèi);隨后逐漸見集落形成，原代培養(yǎng)的時間平均為(14.2±1.45)d，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，細(xì)胞呈長梭形旋渦樣生長(圖1);傳代后細(xì)胞生長較旺盛，平均傳代時間(5.8±0.44)d，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。消化傳代的細(xì)胞于24 h內(nèi)完全貼壁，形態(tài)與健康對照組相似(圖2)。

圖1 原代培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞呈長梭形旋渦樣生長，幾乎鋪滿了瓶底

圖2 消化傳代的細(xì)胞于24 h內(nèi)完全貼壁，形態(tài)與原代細(xì)胞相似

2.1.2 體外擴增不成功者 MSC生長情況與健康對照組相比較：同等骨髓量分離得到的單個核細(xì)胞數(shù)量與健康對照組相比明顯減少，且貼壁的紡錘形、梭形細(xì)胞的出現(xiàn)時間明顯較晚，一般于6～7 d，且僅零星分布，不成集落生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，其中2例可見細(xì)胞少量擴增，培養(yǎng)至第15天，約見20% ～30%融合的短梭形細(xì)胞生長(圖3)，至第30天，細(xì)胞基本自行凋亡;另2例至第18天，見部分長梭形細(xì)胞零星分布，融合少于10%(圖4)，至第30天細(xì)胞基本自行凋亡(圖5)。

圖3 原代培養(yǎng)15 d后，可見個別短梭形細(xì)胞生長集落

圖4 原代培養(yǎng)18 d后，長梭形細(xì)胞零星分布，融合少于10%

圖5 原代培養(yǎng)30 d后，部分細(xì)胞自行凋亡

2.2 MSC表面分子的表達 流式細(xì)胞術(shù)檢測BM-MSC細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示體外擴增成功的SLE患者BM-MSC均高表達 CD29、CD44，而不表達 CD34、CD45，第 3 代 BM-MSC 純度達95%以上，且各表面標(biāo)志的表達與健康對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 MSC的生長情況 SLE患者第2代MSC生長趨勢與健康對照組相似，第3～4天生長活躍，第4天后生長漸緩，第5-6進入生長平臺期。見圖6。

圖6 SLE患者與健康對照組第二代MSC生長曲線

3 討論

MSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的一群干細(xì)胞，體外培養(yǎng)易純化、擴增迅速，具有支持造血、免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)免疫耐受的作用。本實驗進行了9例SLE患者和5例健康對照者MSC的體外培養(yǎng)。健康對照者MSC均能成功體外擴增。9例SLE患者中，5例可以傳代擴增，傳代率為55.6%。有4例SLE患者MSC不能成功傳代擴增，說明部分SLE患者MSC存在缺陷。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)能成功傳代的5例SLE患者MSC無論是從細(xì)胞形態(tài)、原代培養(yǎng)所需時間、平均傳代時間及表面特異性分子表達均與健康對照組無明顯差異，所培養(yǎng)、擴增的細(xì)胞能達到臨床應(yīng)用的要求。提示這部分SLE患者MSC生物學(xué)特性基本正常。

對兩組擴增情況不同的SLE患者的臨床資料進行比較，我們發(fā)現(xiàn)未能成功體外擴增的SLE患者具有如下的臨床特征：①年齡較大。②病程較長。③合并有較嚴(yán)重的血液系統(tǒng)損害。④長期大劑量應(yīng)用免疫抑制劑。

大量實驗發(fā)現(xiàn)，MSC的生物學(xué)特性與年齡密切相關(guān)。骨髓中MSC的含量、質(zhì)量以及細(xì)胞活性隨著年齡的增長而下降［4，5］。骨髓中MSC的克隆數(shù)隨著年齡的增長而逐漸減少，且 BM-MSC 分泌 SCF、FLT-3L、IL-6、TGF-β1 及 SDF-1 等與自我更新密切相關(guān)的細(xì)胞因子的能力逐漸下降，導(dǎo)致BM-MSC的增殖能力逐漸減弱。另外，也有研究者指出［6］，病情較重的SLE患者，從骨髓中可提取的單個核細(xì)胞數(shù)原本就較少，所含MSC就更少。然而SLE病情輕重、病程長短及不同藥物治療是否會影響SLE患者MSC的體外擴增、生物學(xué)特性及功能，目前尚未能明確。

我們實驗說明SLE患者MSC存在一定的異質(zhì)性，因此應(yīng)用MSC治療SLE前，了解患者自身MSC是否存在缺陷是必需的。如果患者MSC本身存在缺陷，為避免治療失敗或復(fù)發(fā)，異體MSC輸注為首選;如果 MSC本身基本正常，自體MSC輸注將是有效的。SLE患者MSC的體外擴增及其生長特性是協(xié)助我們評價SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面，為SLE患者MSC移植的治療方法提供了理論依據(jù)。

［1］Haynesworth SE.Baber MA Caplan.Al Surface antigen on human marrow-derived mesenchymal stem cells are detected by monoclonal antibodies.Bone，1992，13：69-80.

［2］Tse WT，Pendleton JD，Beyer，et al.Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells：implications in transplantation.Transplantation，2003，(75)：389-397.

［3］Tse WT，Pendleton JD，Beyer et al.Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells：implications in transplantation.Transplantation，2003，(75)：389-397.

［4］Kotev Emeth S，Savion N，Pri2 chen S，et al.Effect of maturation on the osteogonic response of cultured stromal bone marrow cells to basic fibroblast grow th factor.B one，2000，27：777-783.

［5］Service RF.Tissue engineering build new bone.Science，2000，289(5484)：1498-1500.

［6］孫凌云，侯業(yè)義，范樂明，等.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的初步研究.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2005，9(10)：586-589.