王昆 吳陽 楊昱 劉超

結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為TGF-β的下游效應介質(zhì)，在高糖血癥-轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)-CTGF-腎間質(zhì)纖維化模式中起著重要的作用。而阻斷CTGF導致的腎小管間質(zhì)纖維化將有效延緩糖尿病腎病的發(fā)展。

研究表明[1]，肝細胞生長因子(HGF)在糖尿病腎病發(fā)展過程中存在著潛在的治療作用。而目前，多數(shù)研究均著重于HGF阻斷TGF-β所致的腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞纖維化，但對于CTGF在阻斷上述過程中的作用并不明確。本實驗先前的研究表明HGF對CTGF的表達有抑制作用，如能證明其對CTGF所致腎小管上皮細胞纖維化過程亦有阻斷作用將進一步為HGF治療糖尿病腎病提供有效證據(jù)。

本試驗將通過觀測rhHGF對CTGF刺激下腎小管上皮間質(zhì)纖維化的影響來進一步探討HGF在此過程中的具體作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng)試劑HKC細胞株，重組人HGF(rhHGF，Peprotech公司，美國)和重組人CTGF(rhCTGF，Peprotech公司，美國)。

1.1.2 RT-PCR試劑Trizol(Gibco，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)，PCR試劑盒(Promega，美國)，聚合酶鏈反應引物(英駿生物技術(shù)，中國)。

1.1.3 Western印跡法試劑分光光度儀(Pharmacia Biotech，美國)，垂直電泳儀(BioLabs，美國)，PVDF印跡膜(Millipore，美國)，ECL發(fā)光反應系統(tǒng)(Cell Signaling，美國)，鼠抗人α-SMA單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz，美國)。

1.2 方法

1.2.1 人腎小管上皮細胞株(HKC)培養(yǎng)HKC用含10%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。0.25%胰蛋白酶消化細胞后，以1×106/瓶的密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶。用10%FCS-DMEM/F12培養(yǎng)細胞6 h后，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細胞同步于靜止期。

HKC孵育18 h后，吸棄培養(yǎng)液，分3組:①換以新鮮DMEM/F12營養(yǎng)液(葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)78 h。②換以含CTGF營養(yǎng)液，終濃度為5.0 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)78 h。③換以含CTGF營養(yǎng)液，終濃度為5.0 ng/ml，同時加入rhHGF終濃度濃度分別為50、100和200 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)78 h。

1.2.2 COLA41、FN、α-SMA、CTGF及TGF-β mRNA檢測RT-PCR按Trizol說明書在培養(yǎng)瓶提取細胞RNA，定量后取總RNA2ug作逆轉(zhuǎn)錄，步驟參照試劑盒說明書。取1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以50 μl反應體系進行PCR擴增。取PCR產(chǎn)物5ul在2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并照相，用計算機圖像處理系統(tǒng)處理，以吸光度代表表達量，計算上述產(chǎn)物的相對表達量(即各基因條帶吸光度/β-actin基因條帶吸光度)。至少重復6次獨立的RT-PCR全過程。

Western印跡①SDS-PAGE:分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%的垂直電泳。樣品中加入上樣緩沖液，加熱變性，恒壓120V，電泳7～8 h。②轉(zhuǎn)膜:采用電轉(zhuǎn)移裝置，將電泳后凝膠上的血清成分轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，恒流100 A，8 h。③蛋白印跡反應:雜交反應液置4℃，反應12 h。去離子水漂洗膜后，反貼法覆于混合液滴上孵育5 min，在暗室內(nèi)膠片感光60 s，顯影1.5 min，定影2 min，清水沖凈晾干，結(jié)果用數(shù)碼成像系統(tǒng)掃描，測定光密度值并計算α-SMA與GAPDH光密度比值。

2 結(jié)果

2.1 rhHGF對CTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表達的影響(采用半定量RT-PCR法)。

如圖1所示:rhHGF濃度分別為25、50、100、200 ng/ml，與單純CTGF組比較，F(xiàn)N和α-SMA表達均明顯減少，且其表達量呈劑量依賴性(P＜0.01)。

圖1 rhCTGF刺激后α-SMA基因表達變化

表1 rhHGF對rhCTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表達的影響

2.2 rhHGF對rhCTGF刺激下HKC α-SMA蛋白表達的影響

圖2 rhHGF刺激后α-SMA蛋白表達變化

如圖2所示:rhHGF濃度分別為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml，與單純CTGF組比較，α-SMA蛋白表達量明顯減少，且其表達量呈劑量依賴性。

表2 rhHGF對rhCTGF刺激下α-SMA蛋白表達的影響

3 討論

CTGF屬于CCN(包括Cyr61/Cef10，NOV和ELM-1)家族，富含半胱氨酸，為36～38kDa的單體分泌蛋白，其編碼基因位于染色體6q23。血清生長因子、TGF-β1、骨形成蛋白、糖皮質(zhì)激素、纖維蛋白酶等均可激活其表達[2]。目前，對CTGF的生理功能尚未完全清楚[3]，研究提示[4]，CTGF作為TGF-β的下游效應介質(zhì)，可以介導TGF-β的負面效應，被認為糖尿病腎病發(fā)生與進展的關(guān)鍵因子。

本研究發(fā)現(xiàn)，加入rhHGF后，CTGF刺激下FN、α-SMA表達均明顯下調(diào)，提示HGF可抑制CTGF所致HKC纖維化;同時，不同劑量HGF對纖維化因子表達量的影響，反映了HGF抑制HKC纖維化過程是劑量依賴性的;而rhHGF可在不影響CTGF表達的情況下，抑制后者所致纖維化，表明HGF亦可能通過阻斷CTGF的致纖維化途徑而發(fā)揮作用，但具體機制仍不明確;對比本實驗第二部分結(jié)果，在高糖刺激下，rhHGF下調(diào)非CTGF所致的COL4A1表達，提示HGF抑制HKC纖維化可能還通過CTGF以外的其他途徑。有研究表明[5]，HGF可通過激活細胞外絲裂原活化蛋白激酶(p42/44 mAPK)通路，削弱TGF-β細胞內(nèi)信號傳導蛋白Smad2/3核轉(zhuǎn)位，來阻斷纖維化過程。

綜上所述，本研究認為，HGF可抑制CTGF所致的腎小管間質(zhì)纖維化，表明其可通過阻斷CTGF的下游途徑發(fā)揮其抗腎小管間質(zhì)纖維化的作用，本研究先前實驗提示，HGF的抗腎小管間質(zhì)纖維化作用還可能通過CTGF以外的其他途徑。因此，需進一步研究了解HGF阻斷DN發(fā)展的具體機制，從而充分認識HGF在DN治療中的價值。

[1]Junwei Y，Chunsun D.Hepatocyte growth factor suppresses renal interstitial myofibroblast actovation and intercepts smad signal transduction.Am J Pathol，2003，163(2):621-632.

[2]Inoue T，Okada H，Kobayashi T，et al.TGF-betal and HGF coordinately facilitate collagen turnover in subepithelial mesenchyme.Biochem Biophys Res Commun，2002，297(2):155-160.

[3]Junwei Y，Youhua L.Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial fibrosis.J Am Soc Nephrol，2002，13:96-107.

[4]Herrero I，Torras J，F(xiàn)ranquesa M，et al.HGF gene therapy attenuates renal allograft scarring by preventing the profibrotic inflammatory-induced mechanisms.Kidney Int，2006.