嚴(yán)承歡，施展，石仁賢，萬正杰，徐躍進(jìn)

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430070）

白菜（Brassica compestrisL.spp.pekinensis）為十字花科蕓薹屬白菜種，是我國重要蔬菜之一，栽培面積與產(chǎn)量均居首位。白菜為異花授粉作物，具有極強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，利用雜種優(yōu)勢具有提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗性等優(yōu)點(diǎn)，因此優(yōu)勢雜交育種在白菜育種中占據(jù)著主導(dǎo)地位。雜種一代生產(chǎn)的主要途徑為自交不親和系和雄性不育系，但是利用自交不親和系生產(chǎn)一代雜種存在親本連續(xù)自交易產(chǎn)生生活力衰退、繁殖需人工剝蕾授粉、成本高等缺陷[1]，而細(xì)胞質(zhì)雄性不育系易得到高質(zhì)量雜種一代，且具有制種簡單、應(yīng)用方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[2]，所以細(xì)胞質(zhì)雄性不育成為生產(chǎn)大白菜雜種一代的理想系而被廣泛應(yīng)用。

關(guān)于白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育及應(yīng)用，前人已經(jīng)做過很多研究并取得一些進(jìn)展?？鹿鹛m等[3]以PolCMS為不育源，最早成功地育成了大白菜異質(zhì)源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS3411-7，并率先利用了細(xì)胞質(zhì)雄性不育系配制了秦白4號(hào)[4]等雜種。魏寶琴等[5]以O(shè)gura不育源完成了結(jié)球白菜雄性不育系的選育；孫日飛等[6]從國外引進(jìn)了一個(gè)新型蘿卜胞質(zhì)白菜雄性不育材料NYCMS，經(jīng)過多代回交轉(zhuǎn)育，成功獲得了花器正常、有蜜腺、結(jié)籽正常的不育株。

本研究采用的白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料6w-9605A是以芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育hauCMS為不育源[7，8]，以白菜DH系6w-9605B為輪回親本，通過種間雜交和連續(xù)回交，獲得遺傳穩(wěn)定的BC6白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A。試驗(yàn)從細(xì)胞學(xué)和田間兩方面對新型白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A BC6進(jìn)行花粉活力及染色體數(shù)目鑒定，同時(shí)對各回交遺傳世代的不育性和植物學(xué)表型性狀進(jìn)行綜合鑒定，為白菜種質(zhì)資源的研究及雜種優(yōu)勢的高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A BC6、保持系6w-9605B BC6。所有材料均由國家蔬菜改良中心華中分中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

①田間調(diào)查 3月中旬花開放后，在田間觀察白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A和白菜保持系6w-9605B的植株和花器官形態(tài)，并拍照記錄。

2009-2010年分別在武漢和蘭州對白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 6w-9605A F1，BC1，BC6進(jìn)行了育性鑒定及套袋后結(jié)莢率的調(diào)查。對500個(gè)單株進(jìn)行育性鑒定，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，6w-9605A各回交世代的不育度和不育株率均為100%，且蜜腺正常，植株無黃化現(xiàn)象。

②TTC法花粉活力測定 取少數(shù)6w-102A花粉和6w-102B花藥于載玻片上，花藥用鑷子夾碎，加 1～2滴 TTC溶液，蓋上蓋玻片。將制片于 35℃恒溫箱中放置 15 min，然后置于低倍顯微鏡下觀察，并拍照記錄。凡被染為紅色的則為活力強(qiáng)的花粉，淡紅的次之，無色者為沒有活力的花粉或不育花粉。

③花粉母細(xì)胞染色體數(shù)目觀察 取白菜雄性不育材料6w-9605A BC6的小花蕾，用鑷子剝?nèi)』ɡ僦械拇迫?，放?.002 mol/L 8-羥基喹啉中22℃下處理2 h，蒸餾水沖洗2～3次，卡諾式（無水酒精∶冰醋酸=3∶1）固定24 h。于1 mol/L稀鹽酸中解離8～10 min（60℃），蒸餾水沖洗幾次后置于潔凈的載玻片上，吸水紙吸取其周圍多余水分，解剖針充分壓碎，改良苯酚品紅染液染色5～8 min壓片，在Olympus CX41顯微鏡下觀察，Mshot MD30攝影。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系表型鑒定

白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A花朵開放正常，與保持系6w-9605B的花朵顏色一致，且蜜腺正常，6枚雄蕊分兩輪，外輪2枚雄蕊的花絲較短，內(nèi)輪4枚較長（圖1A、圖1D）。6w-9605A的柱頭明顯高于雄蕊，雄蕊花絲短，花藥干癟呈三角形（圖1A），且無花粉，敗育徹底（圖1B）；6w-9605B的柱頭略高于雄蕊，雄蕊花絲較6w-9605A長，花藥呈盾形，且飽滿有明顯淡黃色花粉（圖1D），花粉活力為 100%（圖1E）。田間觀察6w-9605A苗期植株，發(fā)現(xiàn)并無黃化現(xiàn)象，與6w-9605B相似，說明已基本轉(zhuǎn)育成功（圖1C、圖1F）。

2.2 白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系各世代田間育性調(diào)查

對白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A F1、BC1、BC6的300個(gè)單株進(jìn)行了育性鑒定及套袋后結(jié)莢率的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不育度和不育株率均為100%，說明白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A各世代敗育徹底（表 1）。

2.3 大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系回交后代的染色體數(shù)目

通過對大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A BC6的花蕾進(jìn)行染色體壓片觀察，發(fā)現(xiàn)BC6染色體數(shù)為20（圖2），隨著回交代數(shù)的增加，大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A回交6代的染色體數(shù)目與大白菜的染色體數(shù)已趨于相同。

圖1 白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A及保持系6w-9605B的表型

表1 白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A各世代育性鑒定

3 小結(jié)與討論

細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的來源通常有2種：一是自然繁殖過程中發(fā)生的突變或品種間雜交產(chǎn)生的同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育，如polCMS；二是種屬間遠(yuǎn)緣雜交形成的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核基因重組而導(dǎo)致的異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育[9]。

圖2 大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A的染色體（2n=20）

HauCMS是傅廷棟教授1999年發(fā)現(xiàn)的天然芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育型。本研究以大白菜DH系6w-9605B為輪回親本，通過種間雜交和連續(xù)回交，獲得遺傳穩(wěn)定的大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A BC6。芥菜型油菜的基因型為AABB，染色體數(shù)目為2n=4X=36；大白菜為2n=2X=20，AA。回交轉(zhuǎn)育中，輪回親本的核基因不斷替換非輪回親本的核基因。隨著回交世代的增加，6w-9605A的染色體條數(shù)趨于白菜染色體條數(shù)，說明其核已經(jīng)被保持系核基因組替代，獲得了遺傳穩(wěn)定的大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，這與張艷等[10]的研究結(jié)果一致。同時(shí)對白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A BC6進(jìn)行花器官觀察和花粉活力測定，發(fā)現(xiàn)6w-9605A的蜜腺正常，其花藥呈三角形，干癟無花粉，敗育徹底。

連續(xù)3 a在武漢與蘭州調(diào)查白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 6w-9605A F1、BC1、BC6的不育度和不育株率，發(fā)現(xiàn)各回交世代不育株率和不育度均為100%，說明6w-9605A敗育徹底，且苗期不黃化，可以作為大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的種質(zhì)資源，從而進(jìn)一步加以利用，這為細(xì)胞質(zhì)雄性不育在大白菜雜種優(yōu)勢利用中提供了種質(zhì)資源和理論依據(jù)。

[1]劉玉梅，方智遠(yuǎn)，孫培田，等.十字花科作物雄性不育性獲得的主要途徑及其利用[J].中國蔬菜，2002（2）：52－55.

[2]陳夫貴，趙利民，鞏振輝，等.新型大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系RC7的不育機(jī)理分子機(jī)理探討[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（3）：311－314.

[3]柯桂蘭，趙稚雅，宋胭脂，等.大白菜異源胞質(zhì)雄性不育系CMS3411-7 的選育及應(yīng)用 [J]. 園藝學(xué)報(bào)，1992，19（4）：333-340.

[4]柯桂蘭，趙稚雅，宋胭脂，等.秦白4號(hào)大白菜的選育[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（4）：12-14.

[5]魏寶琴，魏毓棠.Ogura不育源結(jié)球白菜雄性不育系的選育[J].中國蔬菜，1995（5）：18-21.

[6]孫日飛，鈕心恪，司家鋼，等.新型蘿卜胞質(zhì)白菜雄性不育系研究初報(bào)[J].中國蔬菜，1997（4）：32-33.

[7]萬正杰，王顯軍，傅廷棟，等.芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A的細(xì)胞學(xué)觀察[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2006，28（3）：268-271.

[8]Wan Z J,Jing B,Tu J X,et al.Genetic characterization of a new cytoplasmic male sterility system (hau)inBrassica junceaand its transfer toB.napus[J].Theor Appl Genet,2008,116(3):355-362.

[9]Schnable P S,Wise R P.The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration[J].Trends in Plant Science,1998,3(5):175-180.

[10]張艷，王小佳，李成瓊，等.甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料分子鑒定及花器官形態(tài)對核背景的響應(yīng) [J].園藝學(xué)報(bào)，2010，37（6）：915－922.