徐升運(yùn) ，趙文娟 ，馬齊 ，張強(qiáng) ，任平 ，秦濤

（1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，西安，710600；2.陜西省酶工程技術(shù)中心）

番茄灰霉病是一種世界性的重要病害，且為害較重，番茄灰霉病的防治已成為保證生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵性措施[1]。目前防治番茄灰霉病主要采用化學(xué)藥劑，如苯并咪唑類的多菌靈、甲基硫菌靈，二甲酰亞胺類的腐霉利、異菌脲以及N-苯氨基甲酸酯類的乙霉威[2]。長期、連續(xù)使用化學(xué)藥劑使病原菌逐漸產(chǎn)生了抗藥性，影響防治效果，同時易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題[3，4]。據(jù)張傳清等[5]報(bào)道，設(shè)施蔬菜灰霉病菌對百菌清、多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威、嘧霉胺均產(chǎn)生不同程度的抗藥性。因此，利用拮抗菌防治番茄灰霉病日益受到國內(nèi)外研究者的重視，國內(nèi)在這一方面陸續(xù)有研究報(bào)道，以枯草芽孢桿菌為主，也有用木霉防治番茄灰霉病的研究[6]。但單獨(dú)用細(xì)菌或真菌防治番茄灰霉病容易受到病菌的變異影響，降低防效，而應(yīng)用拮抗細(xì)菌和拮抗真菌聯(lián)合防治番茄灰霉病，則可有效提高防治效果。

本研究以本課題組分離出的1株木霉10（Trichoderma10）和1株枯草芽孢桿菌M6（BacillussubtilisM6）菌株的發(fā)酵液，及2種菌的發(fā)酵液混合后制得的復(fù)合菌劑W為材料，對番茄灰霉病進(jìn)行了防治試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

木霉10菌株與枯草芽孢桿菌M6菌株由陜西省科學(xué)院酶工程研究所從土壤中分離保存。有效活菌數(shù)，枯草芽孢桿菌 M6 為 1.0×1010億個/mL，木霉 10 為1.0×1010億個/mL，將 2 種菌的發(fā)酵液按 1∶1 比例配成復(fù)合菌劑W，自行生產(chǎn)。對照藥劑為75%百菌清可濕性粉劑。

番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌MB1從臨潼地區(qū)的番茄病果上分離、純化得到。

番茄品種毛粉802由西安市蔬菜所培育。

試驗(yàn)地點(diǎn)在西安市臨潼區(qū)任留鄉(xiāng)的無公害蔬菜示范基地。試驗(yàn)期間大棚溫度15～25℃。

1.2 番茄灰霉病的抑制試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將灰葡萄孢菌MB1配制成濃度為1.0×109cfu/mL菌液，并制成含菌平板。將木霉10、枯草芽孢桿菌M6和混合菌劑W分別接種在平板上，于25℃培養(yǎng)5 d后分別測定抑菌圈直徑，并計(jì)算抑菌率。每個處理重復(fù)4次。

1.3 復(fù)合菌劑W防治番茄灰霉病的最佳濃度的研究

吸取混合菌劑W培養(yǎng)液2 mL至18 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基中，制成不同濃度的含菌平板，以加入2 mL無菌水的處理為對照。

將制備好的灰葡萄孢菌MB1菌盤移植到上述平板中，每皿1塊，4次重復(fù)，倒置，于25℃培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計(jì)算抑菌率。

1.4 田間防治試驗(yàn)

①田間小區(qū)設(shè)計(jì) 田間試驗(yàn)中將復(fù)合菌劑W稀釋成800倍液、1 000倍液、2 000倍液使用，噴施2次，每次藥液用量30L/667m2；對照藥劑75%百菌清可濕性粉劑800倍液，用量170 g/667 m2，分2次噴施。以清水處理為空白對照。共5個處理，4次重復(fù)，每小區(qū)面積為12 m2。小區(qū)間及試驗(yàn)田間周圍設(shè)保護(hù)行。

②施藥時間 于2010年4月15日第1次施藥（發(fā)病初期），2010年5月10日第2次施藥。

③病情調(diào)查方法 分別在噴藥前1 d和噴藥后1周調(diào)查葉片上的病害嚴(yán)重程度，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。每小區(qū)在對角線上取5點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查2株，調(diào)查各植株全部葉片。

分級方法，0級：無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積5%以下；3級：病斑面積占整個葉面積6%～10%；5級：病斑面積占整個葉面積11%～20%；7級：病斑面積占整個葉面積21%～40%；9級：病斑面積占整個葉面積40%以上[7]。

計(jì)算病情指數(shù)，病情指數(shù)=100×∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總數(shù)×9），防治效果（%）=[1-（CK0×PT1/CK1×PT0）]×100%。

其中，CK0為空白對照小區(qū)施藥前病情指數(shù)，CK1為空白對照小區(qū)施藥后病情指數(shù)，PT0為藥劑處理小區(qū)施藥前病情指數(shù)，PT1為藥劑處理小區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 木霉10、枯草芽孢桿菌M6及復(fù)合菌劑W對番茄灰霉病的抑制作用結(jié)果

平板培養(yǎng)結(jié)果表明，木霉10和枯草芽孢桿菌M6對灰葡萄孢菌MB1的抑菌圈平均直徑分別為15.04 mm 和 23.26 mm，抑菌率分別為18.3%和26.8%。而復(fù)合菌劑W對灰葡萄孢菌MB1的抑菌圈平均直徑為 32.72 mm，抑菌率為 62.2%。

研究發(fā)現(xiàn)，木霉10和枯草芽孢桿菌M6單獨(dú)使用時均對番茄灰霉病具有一定的防效，且枯草芽孢桿菌M6的抑制效果明顯比木霉10好，即其防治效果更好。

另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2種菌混合使用時，抑菌率較單一菌劑顯著提高，對番茄灰霉病防治效果更好。這可能是因?yàn)?種菌協(xié)同作用，從不同的防治機(jī)理方面抑制了番茄灰霉病的發(fā)展。

2.2 復(fù)合菌劑W防治番茄灰霉病的最佳濃度

通過表1可以看出，不同濃度的復(fù)合菌劑W對灰霉病菌菌絲的生長均有抑制作用，當(dāng)濃度大于105cfu/mL時，均對灰霉病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，抑制率均達(dá)到了100%，但當(dāng)濃度為104cfu/mL時，對灰霉病菌抑制作用明顯下降，不能達(dá)到防治目的。因此，復(fù)合菌劑W的濃度應(yīng)不低于105cfu/mL。

2.3 田間防治試驗(yàn)結(jié)果

通過表2可以看出，田間試驗(yàn)中，復(fù)合菌劑W對番茄灰霉病具有較好的防治作用，并且防效隨濃度的增大而提高，以800倍液的防治效果最佳。以復(fù)合菌劑W 800倍液和1 000倍液每7 d噴1次，連續(xù)噴 2次，防效分別可達(dá) 80.75%和 68.30%，75%百菌清液800倍液防效為69.84%，復(fù)合菌劑W 800倍液防效顯著優(yōu)于75%百菌清800倍液的，而復(fù)合菌劑W 1 000倍液防效與75%百菌清800倍液差異不顯著。當(dāng)復(fù)合菌劑W的稀釋倍數(shù)大于2 000時，對番茄灰霉病的防治效果明顯較差。

3 結(jié)論與討論

木霉10和枯草芽孢桿菌M6對灰葡萄孢菌MB1的抑菌率分別為18.3%和26.8%，而復(fù)合菌劑W對灰葡萄孢菌MB1的抑菌率為62.2%，2種菌劑混合使用效果更佳，這可能是因?yàn)?種菌在防治時產(chǎn)生協(xié)同作用。

復(fù)合菌劑W對番茄灰霉病具有良好的防治效果，復(fù)合菌劑W 800倍液防效達(dá)到80.75%，防效顯著優(yōu)于75%百菌清液800倍液；復(fù)合菌劑W 1 000倍液防效與75%百菌清液800倍液相當(dāng)；復(fù)合菌劑W稀釋倍數(shù)大于2 000時防效明顯下降。因此，復(fù)合菌劑W 800倍液和1 000倍液完全可代替化學(xué)藥劑，其中以800倍液的效果更好，可減小農(nóng)殘和環(huán)境污染。

表1 不同濃度復(fù)合菌劑W對灰霉病菌的抑制效果

表2 復(fù)合菌劑W田間試驗(yàn)結(jié)果

[1]葛紹榮，牛莉娜，李銘.番茄灰霉病害及其微生物防治的研究進(jìn)展[J].生物加工過程，2007，5（3）：15-19.

[2]賈曉華.番茄灰霉病菌和油菜菌核菌對嘧霉胺的敏感性基線及番茄灰霉病菌抗藥性研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[3]戴福明，周世明.上海郊區(qū)保護(hù)地主要蔬菜灰霉病抗藥性的初步研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1996，12（4）：73-76.

[4]丁中，劉峰，慕立義.不同抗性型灰葡萄孢Botrytis cinerea對不同作用機(jī)制殺菌劑的敏感性研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，3（4）：59-63.

[5]張傳清，張雅，魏方林，等.設(shè)施蔬菜灰霉病對不同類型殺菌劑的抗性檢測[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，8（3）：245-249.

[6]馬輝剛，李瑞明，胡水秀.木霉素防治番茄灰霉病田間藥效試驗(yàn)[J].植物保護(hù)，1998，24（2）：38-39.

[7]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所生測室.農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1993，45-51.