徐曉輝， 申愛(ài)榮

化療在卵巢癌治療中占重要地位，部分卵巢癌患者對(duì)常規(guī)使用的化療藥物耐藥，是目前化療后卵巢癌患者5年存活率低的原因之一。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在結(jié)腸癌及胃癌組織中高表達(dá)，并與患者的預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)［1］。我們采用免疫組化法檢測(cè)COX-2在上皮性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá)，了解COX-2是否參與上皮性卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并研究COX-2抑制劑塞來(lái)昔布(celecoxib)在體外對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株A2780細(xì)胞凋亡的影響，或可能為上皮性卵巢癌的防治帶來(lái)新思路。

1 臨床資料與分組

組織標(biāo)本收集自河南省婦幼保健院病理科保存的2007年1月至2009年2月的原發(fā)上皮性卵巢腫瘤石蠟標(biāo)本101例及正常卵巢組織9例。其中上皮性卵巢癌65例(惡性卵巢腫瘤組)，患者年齡27～74(56.4±7.8)歲，術(shù)前均未接受過(guò)化療或放療。交界性上皮卵巢腫瘤18例(交界性卵巢腫瘤組)，患者年齡32～62(43.2±6.7)歲。良性卵巢腫瘤18例(良性卵巢腫瘤組)，患者年齡20～53(38.5±4.78)歲。選擇同期行子宮肌瘤切除術(shù)的9例患者的部分正常卵巢組織作為對(duì)照(正常卵巢組)。所有標(biāo)本病理診斷明確。標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片。人卵巢癌細(xì)胞株A2780由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科李紅雨博士惠贈(zèng)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 材料來(lái)源

兔抗人COX-2抗體、SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購(gòu)至福州邁新生物技術(shù)公司。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)均購(gòu)自GIBCO公司。塞來(lái)昔布膠囊，0.2 g×6粒/盒，購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥公司。

2.2 方法

2.2.1 免疫組化染色 所有標(biāo)本石蠟切成5 μm切片，以SP法進(jìn)行免疫組化染色，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)代替一抗作為空白對(duì)照，用肺癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。

2.2.2 A2780細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基為10%小牛血清的RPMI-1640，置于含37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次。

2.2.3 卵巢癌細(xì)胞株A2780細(xì)胞的免疫組化RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)A2780細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞涂到用多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片上，PBS沖洗，2×1 min;95%乙醇固定10 min，以SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

2.2.4 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)A2780細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入不同濃度的塞來(lái)昔布(0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L)，并設(shè)不加細(xì)胞的空白組和只加等體積DMSO的對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后用0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，DNA片段抽提染色，并盡快使用流式細(xì)胞儀分析凋亡率。每種刺激條件的樣本均采用三管法檢測(cè)，每例樣品測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞。

2.3 免疫組化結(jié)果判定

在×400倍光鏡下至少觀察10個(gè)視野，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%判定為陽(yáng)性;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%判定為陰性。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用方差分析，組間兩兩比較采用Tamhane法，取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 COX-2在各種卵巢組織中的表達(dá)

圖1 COX-2在上皮性卵巢癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(×400)

COX-2免疫組化反應(yīng)物質(zhì)均位于細(xì)胞漿，主要彌漫分布于整個(gè)胞漿或沿核膜線狀分布，見(jiàn)圖1。COX-2在惡性(73.8%)及交界性(66.7%)卵巢腫瘤組中的表達(dá)顯著高于良性卵巢腫瘤組(16.7%)及正常卵巢組(11.1%)(P＜0.05)。惡性與交界性卵巢腫瘤組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 COX-2在各種上皮性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá)

3.2 塞來(lái)昔布對(duì)人卵巢癌A2780細(xì)胞株凋亡誘導(dǎo)情況

經(jīng)流式細(xì)胞儀PI染色DNA含量分析，在DNA直方圖可見(jiàn)明顯的凋亡峰(亞G1峰)，對(duì)亞G1峰進(jìn)行定量分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。塞來(lái)昔布藥物濃度在 200 μmol/L、400 μmol/L 和 800 μmol/L 作用48 h，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用均明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率分別為57.54%、62.61%和 99.88%(見(jiàn)圖 2 ～4)，與對(duì)照組(凋亡率為0.09%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著塞來(lái)昔布濃度增加，凋亡峰也隨之升高，且塞來(lái)昔布呈劑量依賴誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡。數(shù)據(jù)見(jiàn)表2和圖5。

圖2 200 μmol/L塞來(lái)昔布作用48 h，細(xì)胞凋亡率為57.54%

圖3 塞來(lái)昔布400 μmol/L作用48 h，細(xì)胞凋亡率為62.61%

圖4 塞來(lái)昔布800 μmol/L作用48 h，細(xì)胞凋亡率為99.88%

表2 不同濃度塞來(lái)昔布作用48 h誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡率(±s)%

表2 不同濃度塞來(lái)昔布作用48 h誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡率(±s)%

注:(1)單因素方差分析，F(xiàn)=3990.556，P ＜0.05(2)Tamhane法組間兩兩比較結(jié)果，任何實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(a組)比較:P ＜0.05

?

圖5 不同濃度塞來(lái)昔布誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡率

4 討論

COX-2是分解花生四烯酸生成各種內(nèi)源性前列腺素過(guò)程中的重要限速酶。目前研究認(rèn)為，COX-2在靜息時(shí)并不表達(dá)，在細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、促癌劑等刺激時(shí)則迅速合成，參與多種病理生理過(guò)程［2］。近年來(lái)的研究表明COX-2參與了肺癌等眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展［1，3］。

本研究結(jié)果顯示，COX-2在交界性及惡性上皮性卵巢腫瘤的陽(yáng)性表達(dá)(分別為73.8%和66.7%)顯著高于良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織(分別為16.7%和 11.1%)(P ＜0.05)，與 Menczer等［4］的報(bào)道一致，說(shuō)明COX-2的陽(yáng)性表達(dá)率隨卵巢腫瘤惡性程度的增加而增高，提示COX-2過(guò)表達(dá)可能參與交界性及惡性上皮性卵巢腫瘤的發(fā)生。

Lee等［5］研究表明，COX-2在卵巢癌的高表達(dá)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，提示COX-2可能通過(guò)刺激腫瘤VEGF生成以參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。Raspollini等［6］研究表明卵巢癌組織中COX-2過(guò)表達(dá)與化療敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)，提示在卵巢癌患者臨床治療中，COX-2抑制劑與常規(guī)一線化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠提高腫瘤化療敏感性。

本研究結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布呈劑量依賴方式誘導(dǎo)體外卵巢癌A2780細(xì)胞凋亡。Vital-Reyes等［7］研究發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布在體外以劑量依賴性方式抑制CAOV3、OVCAR3和SKOV3等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并誘導(dǎo)他們表達(dá)caspase-3的上調(diào)，參與腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。Kim等［8］研究表明塞來(lái)昔布能夠作為化療增敏劑用于陰道細(xì)胞癌的臨床化療。本研究采用SP法檢測(cè)COX-2在A2780細(xì)胞株中呈陽(yáng)性高表達(dá)，由此推斷塞來(lái)昔布在體外誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是COX-2依賴性。

目前關(guān)于COX-2抑制劑抗腫瘤機(jī)制還不清楚，認(rèn)為可能是通過(guò)以下機(jī)制發(fā)揮效應(yīng):(1)抑制PGE2的合成。Li等［9］研究發(fā)現(xiàn)特異性COX-2抑制劑尼美舒利呈劑量依賴性方式抑制小鼠體內(nèi)SKOV-3卵巢腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，該效應(yīng)與腫瘤組織內(nèi)PGE2水平降低有關(guān)。(2)抑制腫瘤新生血管的生成。Lee等［5］研究表明，COX-2可能通過(guò)刺激腫瘤VEGF的過(guò)表達(dá)參與卵巢癌的發(fā)展。(3)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Vital-Reyes等［7］研究證實(shí)塞來(lái)昔布以劑量依賴方式顯著抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，COX-2在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，其可能在交界性及惡性上皮性卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，但是否成為腫瘤標(biāo)記物尚需大樣本的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。另外，特異性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布也有可能用于惡性上皮性卵巢癌的治療。

［1］ Ghosh N，Chaki R，Mandal V，et al.COX-2 as a target for cancer chemotherapy［J］.Pharmacol Rep，2010，62(2):233-244.

［2］ Menczer J.Cox-2 expression in ovarian malignancies:a review of the clinical aspects［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2009，146(2):129-132.

［3］ Menter DG，Schilsky RL，Dubois RN.Cyclooxygenase-2 and cancer treatment:understanding the risk should be worth the reward［J］.Clin Cancer Res，2010，16(5):1384-1390.

［4］ Menczer J，Schreiber L，Kravtsov V，et al.Cox-2 immunohistochemical expression in epithelial ovarian carcinoma and platin sensitivity［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2009，30(5):531-535.

［5］ Lee JS，Choi YD，Lee JH，et al.Expression of cyclooxygenase-2 in epithelial ovarian tumors and its relation to vascular endothelial growth factor and p53 expression［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16(Suppl 1):247-253.

［6］ Raspollini MR，Amunni G，Villanucci A，et al.Increased cyclooxygenase-2(COX-2)and P-glycoprotein-170(MDR1)expression is associated with chemotherapy resistance and poor prognosis.Analysis in ovarian carcinoma patients with low and high survival［J］.Int J Gynecol Cancer，2005，15(2):255-260.

［7］ Vital-Reyes V，Rodríguez-Burford C，Chhieng DC，et al.Celecoxib inhibits cellular growth，decreases Ki-67 expression and modifies apoptosis in ovarian cancer cell lines［J］.Arch Med Res，2006，37(6):689-695.

［8］ Kim SH，Kim SH，Song YC，et al.Celecoxib potentiates the anticancer effect of cisplatin on vulvar cancer cells independently of cyclooxygenase［J］.Ann N Y Acad Sci，2009，1171:635-641.

［9］ Li W，Zhang HH，Xu RJ，et al.Effects of a selective cyclooxygenase-2 inhibitor，nimesulide，on the growth of ovarian carcinoma in vivo［J］.Med Oncol，2008，25(2):172-177.