王 卓， 高長(zhǎng)明， 丁建華， 吳建中， 張曉梅， 張?jiān)f， 李蘇平， 劉燕婷， 曹海霞

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，大量研究表明其病因既有環(huán)境因素的作用，也有遺傳因素的作用。業(yè)已證明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因異常，細(xì)胞增殖、分化和凋亡等有關(guān)。食管癌是世界上第8位常見的惡性腫瘤和第5位常見癌癥死亡原因，全世界每年約有30萬人死于此病，而我國(guó)食管癌的發(fā)病率和死亡率均居世界第一［1］。

JWA基因是由周建偉等率先發(fā)現(xiàn)和克隆的新的環(huán)境應(yīng)答基因，具有活躍的生物學(xué)功能［2］。近期研究已發(fā)現(xiàn)JWA基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群患膀胱癌、胃癌和食管癌、白血病等多種惡性腫瘤的危險(xiǎn)性有關(guān)［3-6］。本研究檢測(cè)分析食管癌患者及其相應(yīng)對(duì)照人群JWA G723T多態(tài)性，以探討其與食管癌易感性的關(guān)系。

1 資料和方法

1.2 基因型分析 采用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和變性高效液相色譜法 (denaturing high performence liquid chromatography，DHPLC)對(duì)JWA G723T多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析。擴(kuò)增引物為Takara公司合成，上游引物:5'-CTTCGGAACCTCAAGAACAAAC-3'和下游引物 5'-TCTGAGGTCTTCTCTCTGAAACATC-3'。PCR反應(yīng)體系總體積均為 25 μL，含有引物 10 pmol，4 × dNTPs 0.25 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，10 × Buffer 2.5 μL，熱啟動(dòng)Taq酶1 U和0.5 μL基因組DNA。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性7 min;95℃ 30 s，62℃ 30 s和72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，94℃變性4 min后，再將PCR產(chǎn)物的溫度按0.1℃/s的梯度降低到25℃，置4℃冰箱保存。

1.1 標(biāo)本收集 1999年8月至2000年9月，在淮安市楚州區(qū)人民醫(yī)院隨機(jī)收集經(jīng)組織病理學(xué)確診的食管癌93例，同時(shí)在患者居住的村鎮(zhèn)收集相同年齡組(按相差5歲分組)、無癌癥病史的一般人群200名為對(duì)照組，抽靜脈血標(biāo)本。血標(biāo)本置乙二胺四乙酸鈉抗凝管，分離白細(xì)胞層。用QIAamp DNA提取試劑盒提取白細(xì)胞DNA，DNA置－30℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物直接上樣到DHPLC儀(WAVE 3500，Transgenomic，USA)進(jìn)行基因型鑒定。流動(dòng)相為0.1 mol/L N-三乙基乙酰胺(分析純)和不同濃度梯度的乙晴，流速0.9 mL/min，選擇application type為mutation，按照儀器設(shè)定的洗脫梯度走樣。雜合子基因型可從DHPLC圖形直接確定，野生型純合子和變異型純合子的DHPLC圖形相同，需與已知純合型混合，經(jīng)過變性和復(fù)性過程，再次上樣DHPLC儀分析確定。結(jié)果JWA基因G723T被區(qū)分為T/T，G/G，T/G三種基因型。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組有7例、病例組有1例未檢出。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用 SAS軟件和Epi-Info軟件進(jìn)行，以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(95%confidence interval，95%CI)表示相對(duì)危險(xiǎn)度，以多因素非條件logistic回歸模型計(jì)算調(diào)整OR及其95%CI，計(jì)算時(shí)調(diào)整了性別和年齡。用Mantel-Haenszel χ2檢驗(yàn)基因型頻率分布差異和相對(duì)危險(xiǎn)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 食管癌與對(duì)照組的均衡性檢驗(yàn) 對(duì)照組男、女性分別為132人和68人;平均年齡±標(biāo)準(zhǔn)差分別為(60.76 ±8.46)歲和(58.72 ±9.54)歲;食管癌組男、女性分別為54例和39例，平均年齡±標(biāo)準(zhǔn)差分別為 (61.20 ±9.49)歲和(58.69 ±7.71)歲。對(duì)照組與食管癌組之間的性別、年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 食管癌組與對(duì)照組的遺傳平衡檢驗(yàn)及基因型分布 對(duì)照組JWA 723 T/T、T/G和G/G基因型的分布頻率分別為65.80%、30.57%和 3.63%，病例組分別為43.48%、44.57%和11.96%，兩組間的基因分布頻率有顯著差異(χ2=15.556，P=0.001)(見表1)。

表1 JWA G723T基因型頻率分布與食管癌易感性的關(guān)系

對(duì)食管癌組和對(duì)照組的基因型頻率進(jìn)行了遺傳平衡檢驗(yàn)，兩組的基因型頻率觀察值與期望值差異無顯著性(χ2分別為0.009 7和 0.002 3，P 值均 ＞0.05)，表明食管癌組和對(duì)照組的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg比例，樣本具有代表性。

與T/T基因型相比，T/G基因型發(fā)生食管癌的性別、年齡調(diào)整比值比上升到1.50(95%CI:1.14～1.95)，G/G基因型發(fā)生食管癌的性別、年齡調(diào)整比值比上升到 4.53(95%CI:1.62 ～12.65)。合并T/G和G/G基因型分析顯示G等位基因發(fā)生食管癌的性別、年齡調(diào)整比值比上升到2.50(95%CI:1.50～4.16)，顯著增加食管癌的易感性(P=0.000 4)。

3 討論

JWA 基因在人染色體的定位是3p14(NT_022423.12)，JWA在大多數(shù)真核生物細(xì)胞中均有較高的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，其啟動(dòng)子序列中含有多種順式反應(yīng)元件(應(yīng)激反應(yīng)元件、佛波酯反應(yīng)元件、高鐵血紅蛋白反應(yīng)元件和熱休克反應(yīng)元件)，而且廣泛參與細(xì)胞對(duì)多種環(huán)境理化因素(如熱休克、非電離輻射、氧化應(yīng)激、多種分化誘導(dǎo)刺激、多種環(huán)境化學(xué)污染物等)的應(yīng)答反應(yīng)，這些反應(yīng)元件是否參與JWA轉(zhuǎn)錄調(diào)控及具體的轉(zhuǎn)錄機(jī)理仍不清楚。JWA基因SNPs位點(diǎn)的存在可能是個(gè)體易感性差異的一個(gè)標(biāo)志，SNPs位點(diǎn)可能影響 JWA對(duì)各種環(huán)境刺激的應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)DNA損傷和修復(fù)過程產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，最終引發(fā)腫瘤的產(chǎn)生。

JWA G723T多態(tài)性位點(diǎn)位于JWA mRNA 3'非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)。我們的研究發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組JWA G723T基因型分布頻率有顯著差異(χ2=15.556，P=0.001)。在調(diào)整了性別和年齡后，與T/T基因型相比，T/G基因型發(fā)生食管癌的危險(xiǎn)性上升到1.50(95%CI:1.14～1.95)，G/G基因型發(fā)生食管癌的危險(xiǎn)性上升到4.53(95%CI:1.62 ～12.65)。然而 Tang 等［4］研究顯示JWA 723 G/G基因型降低了食管癌(OR=0.58，95%CI:0.35 ～ 0.98)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);Shen 等［5］研究也表明JWA G723T等位基因顯著降低了人群患白血病的危險(xiǎn)性(OR=0.53，95%CI:0.37 ～0.78);Li等［3］研究同樣發(fā)現(xiàn) JWA 723 G/G 基因型顯著降低了人群患膀胱癌的危險(xiǎn)性(OR=0.52，95%CI:0.28～0.97)。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相反，原因可能是研究對(duì)象的來源不同，本研究是在患者居住的村鎮(zhèn)收集相同年齡組的一般人群對(duì)照，其他研究的對(duì)象是醫(yī)院內(nèi)對(duì)照;其次Tang等［4］對(duì)食管癌的研究結(jié)果接近臨界值(95%CI:0.35～0.98)，基因型分布頻度差異并不顯著。

現(xiàn)在還不清楚JWA 3'-UTR基因多態(tài)性對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和功能有什么影響，雖然基因的3'非翻譯區(qū)并不翻譯成蛋白，但他常常在維持mRNA穩(wěn)定性方面起著重要作用。如果mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，翻譯就會(huì)受影響，因此該基因多態(tài)性有可能導(dǎo)致酶活性或功能的改變。本研究發(fā)現(xiàn)JWA G723T等位基因顯著增加食管癌的易感性，而該多態(tài)性位點(diǎn)與生活習(xí)慣是否有協(xié)同作用仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

［1］姜孝芳，李惠武.食管癌早期預(yù)警指標(biāo)的研究進(jìn)展［J］.甘肅醫(yī)藥，2010，29(1):15-18.

［2］Chen R，Li A，Zhu T，et al.JWA-a novel environmental responsive gene，involved in estrogen receptor-associated signal pathway in MCF-7 and MDA-MB-231 breast carcinoma cells［J］.J Toxicol Environ Health A，2005，68(6):445-456.

［3］Li CP，Zhu YJ，Chen R，et al.Functional polymorphisms of JWA gene are associated with risk of bladder cancer［J］.J Toxicol Environ Health A，2007，70(11):876-884.

［4］Tang WY，Wang L，Li C，et al.Identification and functional characterization of JWA polymorphisms and their association with risk of gastric cancer and esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population［J］.J Toxicol Environ Health A，2007，70(11):885-894.

［5］Shen Q，Tang WY，Li CP，et al.Functional variations in the JWA gene are associated with increased odds of leukemias［J］.Leuk Res，2007，31(6):783-790.

［6］Zhu YJ，Li CP，Tang WY，et al.Single nucleotide polymorphism of the JWA gene is associated with risk of leukemia:a case-control study in a Chinese population［J］.J Toxicol Environ Health A，2007，70(11):895-900.